超声联合微泡开放血脑屏障的研究进展

钟林宏 祝兴宇 张 渝 杨远梅 陈东鸿 王玉琦 云旦次仁 李 攀

血脑屏障是保持中枢神经系统稳定的特殊解剖学结构，其确保了脑正常生理功能，对脑组织有较好的保护作用，但也会阻碍药物进入颅内，不能在脑组织中达到有效浓度，从而影响对脑部疾病的治疗效果［1］。开放血脑屏障并增强其对药物的通透性能较好地解决上述问题。常见血脑屏障开放方法包括：①开颅进行脑室穿刺，但手术感染风险大且危险性高；②对药物进行脂溶性化学修饰，但会减少药物的利用度，难以达到药物有效浓度且副作用大［2］。因此，如何安全、高效地开放血脑屏障，使药物能在颅内局部达到有效浓度，是目前研究的重点。超声是一种可控的实现血脑屏障开放的有效方法，在微泡定位下具有提高颅内局部药物浓度的潜在能力。超声靶向微泡破坏（UTMD）技术可暂时增加超声聚焦区域的血管通透性，介导药物高效靶向运输至脑部病灶区域，增加脑部特定区域的药物浓度［3］。该方法可以实现相对有效的局部治疗，不会引起严重的神经元损伤，在脑部疾病治疗领域具有广阔的研究前景。但超声强度、辐射时间、微泡材料及剂量大小等均会影响血脑屏障开放的程度及安全性［4］。本文就超声联合微泡开放血脑屏障的方法、安全性评估及防控对策进行综述。

一、超声联合微泡开放血脑屏障的方法

1.高强度聚焦超声（HIFU）联合微泡开放血脑屏障：HIFU的热效应使脑局部组织的温度升高，促进紧密连接复合体蛋白和转运蛋白变性，增加血脑屏障的通透性，以实现血脑屏障的选择性开放。在脑肿瘤的治疗方面，HIFU 联合微泡传递化疗药物能使脑肿瘤内的药物浓度上升，抑制肿瘤生长，从而延长实验动物的生存期［5］。在阿尔兹海默症的转基因小鼠模型中，HIFU联合微泡可减少β-淀粉样斑块负荷，延缓tau蛋白的磷酸化趋势，有效改善小鼠的行为学表现［6］，表明HIFU 联合微泡对神经疾病具有一定的治疗效果。动物研究和临床试验［7］证实，HIFU 联合微泡开放血脑屏障可以有效治疗脑部疾病，能广泛应用于运动障碍病、精神病、脑肿瘤和阿尔兹海默症的治疗，以及减轻神经病理性疼痛。

2.诊断超声联合微泡开放血脑屏障：刘平等［8］使用诊断超声（频率1.7 MHz，机械指数1.3）经大鼠尾静脉注入不同剂量的自制脂质体超声造影剂，经颅超声辐照10 min，随着超声造影剂剂量增加，反映血脑屏障渗透性大小的伊文思蓝染液在脑组织的渗出量也不断增多，其分布与辐照方向一致，渗出区域也局限于超声辐照部位，表明在诊断超声作用下微泡造影剂能够增加血脑屏障的通透性。Xie等［9］使用经颅多普勒（频率1 MHz）联合微泡使猪血脑屏障的通透性增高，效果与单独通过静脉注入微泡的作用相同，经超声辐照120 min 后血脑屏障恢复其原有功能，说明血脑屏障在诊断超声联合微泡或单独使用微泡作用下保持开放 2 h 后关闭。而 Mesiwala 等［10］研究显示，HIFU 开放的血脑屏障在超声处理后72 h内关闭，且在血脑屏障开口区域会出现小范围的脑组织损伤。因此，在保持较低峰值负压的条件下，诊断超声联合微泡较HIFU 联合微泡能更安全地实现血脑屏障的可逆性开放，提高血脑屏障对药物的转运作用。

3.低频超声联合微泡开放血脑屏障：相较于HIFU 与高压力诊断超声对周围正常脑组织的损害风险，低频超声的吸收系数小，组织损伤小，热效应和脑局部组织的温度升高程度可忽略不计。因此，低频超声结合微泡能更安全、快速地诱使血脑屏障的开放，促进生物大分子的吸收。此外，低频超声与微泡介导的靶向基因治疗相结合，不仅可以增强裸质粒DNA在癌细胞中的转染和表达，还可以提高基因治疗的靶向性，减少全身性副作用。程远等［11］经大鼠尾静脉注射微泡（0.5 ml/kg），同时使用43 kHz的低频超声持续辐照大鼠头顶部区域，10 min 后光镜观察到超声辐照区域出现轻微的脑组织水肿，24 h 内基本恢复，无明显的脑实质损害；电镜镧示踪法发现辐照区镧离子通过内皮细胞、基底膜及神经胶质细胞，说明在低频超声联合微泡作用下超声辐照部位的血脑屏障通透性增加，处于开放状态，而轻微的脑水肿形成可能为超声作用下微泡的空化效应使内皮细胞间的紧密连接先撑宽后恢复，表明血脑屏障先开放后关闭；透射电镜可观察到血管结构完整，紧密连接加宽，吞饮小泡增多，可见内皮细胞间的微孔，但并未出现脑组织损伤，说明在低频超声的作用下，微泡发生空化效应撑开紧密连接，能无损伤、可逆性地开放血脑屏障。

二、超声联合微泡开放血脑屏障的安全性评估

1.MRI：可作超声联合微泡处理后评估颅内特定区域损伤程度的检测手段，T2 加权（T2WI）成像可以提供细微的解剖结构信息，T2WI 成像上的低强度信号可提示含铁血黄素或红细胞外渗，以此反映超声联合微泡作用对脉管系统造成的损伤，高强度信号可提示脑水肿的形成［12］；而T1 加权（T1WI）成像则可以显示超声联合微泡处理后血脑屏障通透性的改变，目标区域信号强度的增加表示血脑屏障通透性增强［13］，同时T1WI 成像可用于研究超声处理后血脑屏障开放的持续时间，也可以通过T2WI 或磁敏感加权MRI 序列检测脑微出血的情况，但这些序列对检测分散或不连续的红细胞外渗能力有一定局限［14］。

2.组织学检查：组织学检查较MRI 具有更高的敏感性，可以通过HE染色观察红细胞外渗区来反映超声联合微泡作用对脉管系统造成的损伤，坏死细胞、凋亡细胞和空泡的存在也可以通过HE 染色或其他标记物进行评估［15］。TUNEL 染色可以观察到凋亡小体的存在，而普鲁士蓝染色能够反映含铁血黄素的沉积。此外，伊文思蓝和台盼蓝两种染液因其在生理状态下均无法正常通过血脑屏障，常被用于测定血脑屏障的通透性变化，以及超声联合微泡开放血脑屏障的实验研究。伊文思蓝染液渗出量随血脑屏障通透性的增加而增加，通过分光光度计检测脑组织中的染液含量，能够作为判断血脑屏障开放程度的一种定量指标［16］。

三、超声联合微泡开放血脑屏障的安全性防控

1.超声强度和换能器频率：换能器频率、超声强度和峰值负压均会影响血脑屏障破坏的程度及其安全性。一项对大鼠神经肿瘤模型的实验［17］发现，在1.0 MHz的换能器频率作用下，0.3~0.5 MPa 的超声强度会引起超声辐照脑区域的分散或不连续的红细胞外渗，超过1.5 MPa 则会引起辐照区域的红细胞连续外渗或微出血；而在1.5 MHz 的频率作用下，2.4 MPa 的超声强度会对辐照区域造成坏死性损伤或大出血伴细胞凋亡。有研究［18］发现，高强度峰值负压超声处理会对脉管系统和脑实质造成一定程度的损害，超声波峰值负压为0.6 MPa，驱动频率为0.69 MHz 的HIFU 联合微泡处理4 h 后，可见少量红细胞外渗，而在0.8 MPa 的峰值负压作用下红细胞外渗的数量和大小均显著增加。此外，有研究［19］发现空化效应与超声频率成反比，相对空化值的增加取决于超声频率的减小，在低频超声作用下微泡造影剂更容易发生空化效应。研究［18］也表明超声联合微泡开放血脑屏障后导致的微出血不仅可以避免，还能够在较低的超声功率下实现血脑屏障的开放，而且血脑屏障在较低压力和较低换能器频率下更容易被破坏。随着超声频率的增加，脑组织的衰减程度也在不断上升，可能导致颅骨热量增加而加重组织的热损伤，促使超声焦点的扭曲变形。

2.辐照时间和炎症反应：随着超声辐照时间的改变，HIFU联合微泡介导的血脑屏障开放会对脑组织造成不同程度的炎症反应。通过星形胶质细胞和小胶质细胞的标志物胶质原纤维酸性蛋白（Gfap）及离子化钙结合适配器分子1（Iba1）表达水平的变化可以反映超声干预后脑局部炎症的发展过程。一项对野生型小鼠的实验［19］发现，相对于非超声处理的对侧皮层，经超声处理4 h和4 d后脑皮层中Iba1的表达水平发生了上调，差异有统计学意义（P<0.05），但15 d 后两侧比较差异无统计学意义；而Gfap的表达水平在HIFU联合微泡处理4 d后发生了上调，差异有统计学意义（P<0.05），但4 h 及15 d 后比较差异均无统计学意义。表明HIFU 联合微泡介导的血脑屏障开放可以在一定程度上促进神经胶质细胞的短暂活化，且根据辐照时间的不同，胶质细胞的激活时间也会发生改变，但大多在2周内恢复正常。分离HIFU 处理后的脑微血管可以发现，超声辐照6 h后Ccl2、Ccl3、Ccl7、C3、Illb、Il6、Sele 等与急性炎症发生有关的基因表达均上调，在一定程度上反映了Mcp1、Icam1、Tnfa 和Mmp9 等炎症反应蛋白水平的升高，一直持续到辐照后24 h 上述基因的表达才恢复到正常基线水平［20］。另外，与急性炎症发生有关的Tnf、Icam1、Ccl5、Illb基因表达水平均与血脑屏障通透性的变化程度有关［21］。

3.微泡材料和剂量：研究［22］发现，空化阈值随微泡剂量的减少而增加，较大的微泡剂量更容易引起空化效应，从而加速诱导血脑屏障的开放。而在固定剂量下，较大尺寸的微泡具有更长的循环时间，但在相同的超声参数下，更大尺寸的微泡和更长的有效循环时间意味着更高的出血风险［23］。目前，大多数新型微泡造影剂的直径为2~8 μm，与红细胞相似［24］，经外周静脉快速注射微泡造影剂后，可以通过肺循环顺利进入体循环。随着分子成像技术的飞速发展，近年出现了纳米级超声造影剂，与微米级微泡相比，其在靶向治疗领域上有更好的应用潜能。如纳米脂质体造影剂和纳米碳氟乳剂，不仅具有更好的回声特性，还可以输送更多的活性分子穿过血脑屏障，降低药物的分子毒性并提高治疗效果［25］。

四、总结与展望

总之，超声联合微泡治疗能可逆性地开放血脑屏障，使药物能够靶向递送至脑组织的特定区域，提高药物在颅内的局部浓度。今后应针对优化超声参数、增强微泡的靶向性、延长微泡在目标区域的停留时间及有效控制释放时间进行研究，探讨不同超声参数下超声联合微泡在不同脑部疾病中的应用价值。