益生菌在奶牛炎性疾病和代谢疾病控制中的应用

马大川，李 娟，刘秋晨，林 洋，王效禹，单春乔

(大连三仪动物药品有限公司，辽宁 大连 116000)

目前广泛应用的益生菌制剂主要为活菌制剂和益生菌发酵过程中的培养物。活菌制剂可与动物体内的有害菌竞争生存空间以获得优势地位，同时所产生的代谢产物被动物利用以增强机体免疫和提高生产性能[1-2]；培养物可以为瘤胃内有益微生物提供生长所需的营养物质进而促进其增殖，其中的活性成分也能直接被动物机体利用。奶牛常见疾病中以微生物感染和代谢相关疾病居多，通过抗生素治疗和调整饲料结构往往不能迅速治愈[3]，益生菌虽然不能在奶牛的常见疾病控制过程中起到决定性的作用，但是可以明显减缓病情[4]。本文综述了益生菌制剂在奶牛子宫内膜炎、热应激、能量负平衡以及瘤胃酸中毒中的应用，旨在为微生态制剂对奶牛的疾病的发生和控制方面提供参考。

1 奶牛子宫内膜炎

奶牛子宫内膜炎多发生于分娩至产后21 d这段时间内，常呈现全身症状。表现为体温超过39.5 ℃、阴道处有红棕色水状恶臭分泌物流出、病牛迟钝、食欲不振、心率升高以及产奶量下降等[5]。Klibs等[6]研究发现奶牛子宫内膜炎的发生与子宫微生物菌群的失调有关。母牛在分娩时子宫受损导致致病菌感染是此病的主要原因。例如大肠杆菌释放内毒素脂多糖可损伤子宫内膜细胞，引发炎症反应。通常抗生素治疗5～10 d可使67%～77%的病牛体温恢复到正常的水平，但是却不能有效缓解恶臭分泌物的排出，同时奶牛的生殖能力也没有得到有效改善[7]。除抗生素外，益生菌的使用也能在一定程度上缓解奶牛子宫内膜炎。Sandra等[8]将复合乳酸菌菌制剂(鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和罗伊氏乳杆菌以25∶25∶2的比例)灌注病牛子宫，结果显著减少了病牛炎症标志物(IL-8、IL-1β和IL-6)的分泌。大肠杆菌感染子宫内膜上皮细胞6 h后就会对其产生明显的变化，呈现出严重的细胞核固缩以及折光率的改变，而经过乳酸菌前处理后细胞形态结构基本正常。说明乳酸菌可在一定程度上缓解大肠杆菌对细胞的破坏作用[9]。在对奶牛阴道注入乳酸菌时，尽管乳酸菌没有到达子宫内膜，但是由于乳酸菌的使用改变了阴道环境，也达到了限制了大量有害菌到达子宫的目的[10]。奶牛在分娩过程中可能伴随着中性粒细胞吞噬功能受损，导致子宫抗细菌感染能力下降。Genís等[11]使用不同乳酸菌的组合对奶牛子宫内膜炎患病率以及中性粒细胞炎症标志物表达量进行了研究，结果发现阴道治疗使子宫炎患病率降低了58%；子宫和阴道治疗降低了血液中性粒细胞基因的表达，子宫内膜中促炎标记物的表达在子宫和对照奶牛之间差异不显著。子宫内膜作为子宫的第一道防线，可以识别脂多糖，产生促炎性细胞因子来应对大肠杆菌的入侵。硏究证明,奶牛子宫内膜细胞能够通过TLR4下游的MyD88依赖性信号途径识别脂多糖，进而增加IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA水平的表达。鼠李糖乳杆菌通过衰减MyD88依赖性和非依赖性信号传递途径的信号转导，以及加强NLRs和TLRs之间的相互作用，抑制大脑杆菌诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞NF-kB信号通路的激活，进而减少了炎性细胞因子IL-1β、IL-18、IL-8、TNF-α、IL-6、IL-10和IFNβ的释放，从而减轻了大肠杆菌诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞的炎性损伤作用[9]。

2 奶牛热应激

热应激(Heat stress，HS)是奶牛最重要的环境应激源之一，在全球环境不断变化的情况下，HS已经严重影响到了奶牛的生产性能、繁殖性能，并对奶牛健康产生了严重的威胁[12]，其中气候湿润的亚热带地区所受的影响将会更大[13]。我国以荷斯坦奶牛为主，其自身散热性差，产热大，对HS尤为敏感。炎热环境直接导致了奶牛采食量下降，严重时可通过破坏瘤胃上皮黏膜完整性和内环境稳态、影响菌群的定植、降低饲料转化率和生产性能[14]。酵母及培养物具有蛋白含量高、易吸收的特点，并且含有丰富的营养物质，在奶牛HS时可有效缓解由采食量不足引起的营养素缺乏。刘旭日等[15]研究表明，酵母培养物饲喂HS的泌乳早期奶牛可显著增加其干物质采食量并增加产奶量，提高营养物质消化率。瘤胃微生物为奶牛提供了70%的能量需求和50%的蛋白质需求[16]，HS改变了瘤胃微生物的结构和丰度，使淀粉和纤维分解菌的丰度降低。酵母培养物可调节瘤胃微生物平衡，增加纤维分解菌的数量和乳酸利用菌数量，提高营养物质的消化率[17]。

HS可影响奶牛的免疫系统。HS可显著影响奶牛的先天免疫，使细胞因子表达失调，甚至诱导免疫抑制，HS也可通过降低血液中的免疫球蛋白含量来影响体液免疫。最近研究表明，HS通过bax/bcl-2途径诱导奶牛细胞凋亡[18]。酵母细胞壁提取物酵母多糖(yeast polysaccharide，YPS)在调节免疫反应和抵抗氧化应激方面具有明显的作用。同时，YPS还能显著逆转上述由HS引起的免疫系统变化。其中，YPS通过提高血清中IgG、IgM、IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α含量，以提高奶牛的体液免疫；YPS通过刺激相关细胞因子的生成，使bcl-2/bax-α比值降低。除此之外，YPS通过诱导TLR2对多种免疫细胞起到保护作用[19]。因此，推测YPS可通过激活TLR2信号来减轻热应激诱导的免疫抑制。反映在临床上则表现为酵母多糖显著提高了奶牛干物质摄入量和产奶量，增加血清中IgA、IL-2和TNF-α含量，提高肝脏Bcl-2/bax-α比值[20]。

HS还会影响奶牛的代谢活动。HS使奶牛的红细胞、血红蛋白含量的下降，引起奶牛供氧不足；并且随着应激时间的延长，自由基产生增多，清除缓慢，导致代谢紊乱。于枫等[21]将YPS以10 g/头/d的剂量饲喂HS下的奶牛，结果与对照组相比，YPS组产奶量提高了34%，同时血清中离子成分含量、血液红细胞数、血红蛋白、红细胞压积含量血液也显著高于对照组，谷胱甘肽过氧化物酶含量也较对照组提高42%。表明YPS提高了HS下奶牛的抗氧化能力，增强了对应激的抵抗力。

3 奶牛能量负平衡

奶牛围产期产奶高峰早于采食高峰而呈现能量负平衡(Negative energy balance，NEB)，奶牛产生NEB、以及产生NEB后恢复的程度显著影响了奶牛的生产性能和繁殖性能[22-23]。引起NEB的原因有干物质采食量下降、泌乳的增加、血液中非酯化脂肪酸的抑制作用以及挥发性脂肪酸与瘤胃微生物的种类、数量比例等[24-25]。除此之外，围产期奶牛日粮由高粗日粮向高精日粮转换时，丙酸生成菌反刍月形单胞菌和埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii，M．elsdenii)减少导致了丙酸供给不足是促进NEB的一个重要原因。研究发现，将酵母菌与丙酸生成菌进行混合培养可显著提高丙酸的生成量。酵母菌的生长为丙酸生成菌提供了乳酸、B族维生素、葡萄糖、氨基酸等营养物质，有利于反刍月形单胞菌和M.elsdenii的生长与代谢[26]，将复合酵母菌灌服围产期奶牛后，瘤胃丙酸生成菌数量也有显著提高，挥发性脂肪酸含量也有所上升。除了影响营养代谢外，NEB还会影响脂肪动员、激素分泌、卵泡发育、血液代谢，损害奶牛生殖机能，诱发炎症[27]。孙光野等[28]研究发现，发生NEB的奶牛血液中的Ca、Mg水平显著低于正常水平，同时，IL-1、IL-2、IL-6、HP、CRP、TNF-α的水平却显著高于正常值，这便说明了奶牛在发生NEB时机体产生了严重的免疫抑制。酿酒酵母(SC)细胞壁的主要成分有α-D-葡聚糖、β-D-葡聚糖以及几丁质等，能与免疫细胞相互作用，刺激巨噬细胞、自然杀伤细胞、单核细胞和中性粒细胞发挥作用，从而提高先天免疫和体液免疫[29-30]。补充SC不仅能增强消化和营养价值，而且还能提高平均每日体重增加、饲料转化率和血液成分，从而提高先天免疫和体液免疫。Punetha等[31]将SC、朊脂和甜味剂混合制成奶牛膳食补充剂饲喂NEB卡兰-弗里斯(Karan Fries，KF)奶牛，结果发现与对照组相比，试验组奶牛的干物质采食量有所改善；β-羟基丁酸浓度较低，奶牛能量状态有所改善。同时试验组淋巴细胞增殖明显高于对照组，导致IL-1β和TNF-α表达增加。高表达的炎性细胞因子表明奶牛处于应激状态，α-D-葡聚糖和β-D-葡聚糖是酵母细胞壁的主要成分，它们直接与免疫细胞相互作用，提高了免疫效果[32]。

4 奶牛瘤胃酸中毒

奶牛采食了大量易发酵的碳水化合物并超过了瘤胃缓冲能力时，瘤胃内丙酸等挥发性脂肪酸和乳酸大量积累，引发瘤胃酸中毒(rumen acidosis，RA)。当瘤胃pH降到6.0以下，便会出现临床症状[33]。当pH处于5.0～5.5时为亚急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)，当pH降到5.0以下时为急性瘤胃酸中毒(ARA)。发生RA时瘤胃内乳酸利用菌和生成菌严重失衡，导致乳酸大量积累，从而破坏营养物质的利用，损害胃肠道微生物群的功能，降低胃肠道上皮细胞的吸收和屏障能力[34]。由于SARA和ARA的pH都很低，大多数革兰氏阴性细菌都会发生分解，从而导致内毒素(如脂多糖)释放到瘤胃液中，引发全身炎症[35]。离子载体莫能菌素是由链球菌产生的抗菌化合物，对革兰氏阳性菌有选择性的抑制作用，使革兰氏阴性菌得以存活。莫能菌素钠是预防肉牛ARA最常用的离子载体[36]。Reis等[37]将4×109cfu/只/d的酿酒酵母添加于绵羊日粮中，与33 mg/kg莫能菌素(总干物质摄入量)以及对照组比较，对将蔗糖注入瘤胃的绵羊ARA模型来说，酿酒酵母组有效的减少了绵羊瘤胃乳酸的积累，降低了瘤胃渗透压，明显好于莫能菌素组的降低瘤胃pH的下降率。M．elsdenii是瘤胃中主要的乳酸利用菌，能够降低乳酸浓度，使瘤胃pH升高。M．elsdenii在瘤胃中可同时以葡萄糖、麦芽糖和乳酸作为底物。当牛被饲喂以淀粉为主的高精日粮时，M．elsdenii首先利用乳酸，当乳酸的含量极低时才会利用葡萄糖、麦芽糖，这种底物的选择顺序对缓解RA至关重要[38]。而且，随着饲喂可溶性糖的增加，M．elsdenii对乳酸的发酵作用也会增加。M．elsdenii对pH耐受的阈值为5.4，这就保证了在发生SARA时，瘤胃中大多数细菌裂解死亡的情况M．elsdenii下仍能大量增殖。牛链球菌(Streptococcusbovis，S．bovi)为主要的乳酸生成菌，由于其胞内pH能够随着胞外pH的变化而变化，因此酸度对于S．bovi的生长影响不大。所以当瘤胃环境降低到5.0以下时，S．bovis仍能大量利用葡萄糖，迅速增殖，在菌体内通过一系列的酶促反应最终生成乳酸[39]。瘤胃接种M．elsdenii可以有效缓解RA[40]，其不仅可以将大量乳酸代谢为挥发性脂肪酸，而且还能与S．bovis竞争葡萄糖底物，从而限制了乳酸生成[41]。不同来源的M．elsdenii均在一定程度上降低了瘤胃中乳酸浓度[42]，将瘤胃pH维持在了合理的范围内[43]。在添加剂量的选择上，Kung等[44]发现在人工瘤胃液中添加8.7×106个/mL的M．elsdenii可使pH始终维持在5.3以上，并且可大量分解乳酸。而6×107个/mL的M．elsdenii407A可显著降低瘤胃乳酸浓度，提高pH，减轻RA[45]。

5 小 结

益生菌制剂在应对奶牛常见疾病方面展现出了不错的应用效果，在目前抗生素使用日益严峻的情况下，为牧场应对疾病提供了一个良好的思路。但是益生菌的使用还不能完全起到药物所带来的效果，因此也仅仅是能作为辅助手段来缓解疾病的进程。有些慢性疾病在发生初期症状不是十分明显，持续的使用益生菌制剂可以起到很好的预防作用。开发更有针对性的益生菌制剂以及益生菌制剂的重要活性成分会给益生菌的使用带来更广阔的空间。同时，对于益生菌的使用应更倾向于日常的保健方面，提升动物的免疫力，增强抗病力、抗应激能力以应对恶劣环境下动物的健康状况。结合科学的牧场管理，合理的饲料配方，从而将动物的疾病发生控制在最低水平。在益生菌制剂的研发上，外源添加的益生菌制剂能否与瘤胃内微生物之间形成稳定的体系，以及其能够持续发挥作用的时间也是值得深入研究的问题。所以，要想在奶牛饲养过程中用好益生菌制剂，还有许多基础工作需要完成。