探究四种兰科植物的繁殖能力及培育方法

韩萱

（北京中学，北京 100018）

1 研究背景

西双版纳是我国现存面积最大的热带雨林地区，它位于中国云南省南部，地处北回归线以南的热带北部边沿，受印度洋、太平洋季风气候影响，终年温暖、阳光充足、湿润多雨，是中国热带雨林生态系统保存最完整、最典型的地区，也是当今地球上少有的植物基因库，被誉为地球的一大自然奇观，是一个丰富多彩的“植物王国”。

兰科植物药用价值高，但对生长环境要求苛刻，加之人们肆意破坏，现已成为濒危物种。兰科植物种类繁多，大多数的兰花样品属于石斛属，许多种类均是名贵的中药材。在《神农本草经》中，“石斛”被列为上品，因此已造成掠夺性采挖，加上对生长环境要求苛刻，繁殖缓慢，自然更新能力差，而且仅在我国云南和广西有大范围的种植和栽培。

随着人们保护环境、保护生物多样性、保护濒危物种意识的提高，兰科植物的繁殖和栽培也已引起人们的重视，研究人员也在积极的探寻一种加快兰科植物繁殖、改善其种植环境的新方法。兰花喜湿润，忌渍涝。盆土水分过大，喜凉爽，忌高温，喜阴，忌阳光直射。

为了能培育兰科植物并回归自然，减少人力和财力的消耗，我们将通过使用TTC 染色法对选择的金钗石斛、竹枝石斛、鼓槌石斛、冬凤兰等四种常见的兰科植物种子的活力进行测定并选择活力较高的兰科植物种类进行培育，从而探究四种兰科植物的繁殖能力和种植方法。希望能够通过我们的研究加快培养兰科植物的生长速度。

2 研究目的

（1）了解真菌对兰科植物萌发的影响；

（2）探究四种兰科植物种子的繁殖能力及培育方法；

（3）提出合理科学地选择并培育兰科植物的建议。

3 研究方法

3.1 工具及仪器

洁净工作台、电热鼓风干燥箱、立式压力蒸汽灭菌器、显微镜、计数器、电子天平、电磁炉试、注射器、无纺布、载玻片、盖玻片、兰花瓶、锅、纯净水、pH 试纸、玻璃棒、量筒、烧杯、培养皿、锥形瓶等。

3.2 材料及药品

金钗石斛、竹枝石斛、鼓槌石斛和冬凤兰四种兰科植物成熟种子、已萌发兰科植物幼苗、兰科植物菌根菌、TTC、4%次氯酸钙溶液、1%吐温80 溶液、纯净水、MS 母液、蔗糖、琼脂、活性炭、土豆、葡萄糖、琼脂。

3.3 实验步骤

3.3.1 种子预处理

将从野外采集回来的种子放在干燥器里，去除种子表面的水分后装进收集管内密封，并放入4℃冰箱保存。

3.3.2 TTC 染色法测定兰花种子活力

将注射器顶端用45μm 孔径的纱布封住，防止种子出来；将少许经过预处理的兰科植物种子放入注射器针管；将4%的次氯酸钙和1%吐温801:1 混合，用玻璃棒搅拌充分混合；用注射器抽进7mL 混合液，排出空气，振荡均匀，静置20min；排出混合液，抽进纯净水，摇晃注射器，再排出纯净水，反复三次清洗；抽进7～8mL 纯净水，放到阴凉处静置24h；将注射器中的纯净水排出，将少许TTC 倒进小烧杯内，用注射器吸入5～6mL，放入30℃电热鼓风干燥箱，静置24h；染色毕，排出TTC，吸入至少6mL 的纯净水，振荡注射器，排出纯净水反复三次，最后一次留下少许纯净水。

3.3.3 真菌培养基（PDA 培养基）的配置与菌根菌的培养

准备200g 左右的土豆一块，洗净、削皮、切块，开水煮30min；同时各量出20g 的葡萄糖和琼脂，准备培养皿，并使用灭菌锅消毒；将土豆块捞出，留下剩余液体，用四层纱布过滤至烧杯中，再用四层纱布将液体过滤到最大测量值大于等于1L 的量筒中，补充纯净水至1L；从量筒中倒出一部分液体与琼脂混合，搅拌至糊状。加入葡萄糖、琼脂糊，加热；将液体培养基分别倒入四个锥形瓶250mL，封口，用灭菌锅灭菌；用超净工作台给培养皿紫外线灭菌，点燃酒精灯，将兰花培养基从灭菌锅中取出，用酒精灯加热锥形瓶瓶口消毒，将液体培养基倒入培养皿，厚度为4mm 左右，以此类推，直至加工完所有液体培养基。等待所有PDA 培养基冷却凝固；用酒精灯加热接种针消毒，直至烧红，静置冷却。用接种针剜下一小块兰花的菌根菌，放到培养皿正中间；合闭培养皿，加热边缘消毒，用保鲜膜包裹2～3 圈，以此类推，加工完所有培养基。放入培养箱，等待萌发。

3.3.4 兰花培养基（MS 培养基）的配制与兰花苗的移植

加入工作液：大量元素、氯化钙水各200mL，微量元素、有机元素、铁盐各加10mL；纯净水定容至2L，煮沸。添加蔗糖50g、琼脂16g、黑炭2g，搅拌均匀，煮沸；将液态培养基分别倒入32 个培养罐内，深度在1cm 左右。等待培养基冷却、凝固；将兰花培养基放入超净工作台半小时紫外线灭菌。将镊子放入327℃左右的接种器械灭菌器灭菌，取出长满石斛幼苗的培养罐两个；点燃酒精灯，用酒精灯加热培养罐与MS 培养基罐罐口灭菌，并打开罐盖；加热镊子消毒，再将镊子插入MS 培养基冷却；用镊子轻轻将石斛苗夹入MS 培养基，生长点朝下，叶子朝上，每个MS 培养基罐放入4 个左右的苗，以此类推，移植到全部32 个培养罐内；操作完成后，镊子用75%的酒精消毒后放回接种器械灭菌器。用保鲜膜包裹MS 培养基罐盖子与罐身的接口处，缠2～3 圈，隔绝其他真菌；将全部培养罐整齐地摆放在组培室架子上。

4 兰科植物与真菌的关系

真菌与兰花形成了一种共生的关系，真菌有助于兰科植物对氮磷钾等元素的吸收，也有文献报道真菌能分泌激素，从而促进兰花的生长。培养基是根据培养对象所需营养配置的一种固态的营养来源，能为兰花提供生长所必需的营养，相当于真菌的作用。兰花自己会主动找到适合的真菌，但用培养基培养兰花省去了兰花自己寻找真菌的不确定性，加快了萌发速度，让兰花长得更好。虽然无菌培养已成为如今挽救兰科植物必不可少的一个途径，但其中却仍存在着无菌苗易退化，移栽成活率低、病害严重等问题。

5 结果分析

5.1 兰科植物对生长环境要求苛刻

据资料显示，光照时间、温度、湿度、是否通风都会影响兰花的生长。当光照不足时，兰株软弱徒长；光照过强时，叶子会被晒黄或晒焦，失去观赏价值甚至死亡。兰花的栽培温度随着产地和品种的不同各不相同。种植兰花的湿度要维持在80%以上，冬季为半休眠期，这时湿度可降至50%亦可。种植兰花的场地必须要保持良好的通风环境，在我们种植过程中，通过观察发现兰花苗在营养条件较好的情况下生长得十分旺盛，但这也会导致兰花苗生长过于集中而营养不足而死。兰花苗移植实验就是针对此情况来改变兰花苗的生长环境，使每株兰花苗都能获取到足够的养分。

5.2 竹枝石斛的繁殖能力最强

从数据中可以看出，四种兰花种子中，竹枝石斛种子的染色率，即种子的成活率最高，因此在冬凤兰、鼓槌石斛、金钗石斛和竹枝石斛这四种兰花中，竹枝石斛的繁殖能力最强。在进行染色实验的四种兰科植物里，竹枝石斛的活力比较高。TTC 染色的成功与否及着色程度主要取决于温度、pH、浓度、保存时间以及种子的采集日期。TTC 浸泡种子保存时的温度一般在30～35℃，pH正常应在6.5～7.5 之间，实验所用的TTC pH 为6；TTC 浸泡种子的时间因被染色体的不同而不同，而四种实验对象的种子浸泡时间均为24h；为了方便计算从采集种子到做实验之间相隔的时间，确保种子不会因为储存时间过久而全部死亡，四种兰花种子的采集日期在上文已有记录，不过四种兰花种子的采集时间距做实验的时间均较近，可以确保种子正常的存活率。从整体分析，兰花种子在TTC 中浸泡的时间不够，所以四种兰花种子的染色程度也不一样。

6 研究结论与建议

竹枝石斛适合大量培养并回归自然以保护兰科植物，先在实验室内培养兰花及兰花种子萌发所需的真菌可以有效地促进兰科植物的繁殖，建议科研人员利用含有真菌的培养液大量培养竹枝石斛并回归自然。