响应面法优化玫瑰红豆复合米酒发酵工艺

彭春芳，袁松林，刘琨毅，陆 兵，李秀萍，陈 卓

（1.宜宾职业技术学院 五粮液技术与食品工程学院，四川 宜宾 644003；2.宜宾市金喜来酒业有限公司，四川 宜宾 644104）

玫瑰（Rosa rugosa）为蔷藻科灌木植物，花色艳丽，花香芬芳浓郁，花瓣中含有花青素、多酚、抗氧化剂、维生素等多种营养元素[1]。玫瑰花具有抗氧化、调节内分泌、行气活血、改善脾胃、解郁安神等功效[2-4]。经常食用含玫瑰花的食品可以增强体质、改善肤质，因此深受广大女性青睐。

赤小豆（Vigna umbellata）是豆科一年生草本植物[5]，其成熟的种子颜色暗红，民间俗称为红豆。其富含黄酮、酚类化合物、蛋白质、超氧化物歧化酶等多种活性成分[6-8]。红豆是药食同源食物，具有清热解毒、行血补血、利水消肿、健脾去湿等功效[5，8]，常用于制作各种食品。

米酒又称甜酒酿，是我国传统发酵型饮品，以糯米为主要原料，蒸煮糊化后加入酒曲经特殊发酵工艺酿制而成[8]。米酒酸甜可口、醇香诱人，酒精度低，可以直接饮用，也可用于制作各种小吃美食，深受消费者欢迎。此外米酒还具有极高的营养价值和保健功能[9]。在民间，甜米酒早已成为开胃健脾、产妇催奶的绝好佳品。

目前，米酒产品开发主要集中在添加某一种谷物、花卉、水果或保健食材，而用多种食材加工复合米酒的研究比较少[10-11]。玫瑰和红豆的组合在食品加工中运用广泛，但将二者结合在米酒制作中尚缺乏研究。该试验以食用玫瑰、红豆及糯米为原料，采用单因素试验考察不同因素对玫瑰红豆复合米酒品质的影响，再利用响应面试验设计优化发酵工艺，研制出一款清新雅致，独具特色的复合米酒，为复合米酒开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

食用玫瑰（干花）、红豆（赤小豆）、糯米：市售；安琪甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；氢氧化钠、硫酸铜、次甲基蓝指示剂、苯酚、氯化钾（均为分析纯）：成都市金山化学试剂有限公司；盐酸、硫酸（均为分析纯）：天津市化工三厂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FA1004型电子分析天平：上海上平精密仪器有限公司；LDZX-30KBS型高压灭菌锅：上海申安医疗器械有限公司；BJPX-400型恒温培养箱：卓绝医疗器械有限公司；JS39D-250型榨汁机：浙江绍兴苏泊尔生活电器有限公司；C21-RT2120型电磁炉：美的生活电器有限公司；HH-2型恒温水浴锅：上海力辰西仪器有限公司；PHSJ-4A型pH计：上海雷磁仪器有限公司；LMN5D-5L发酵罐：骆易家玻璃制品厂；1 000 mL真空抽滤装置：上海晖创化学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰红豆复合米酒加工工艺流程及操作要点

操作要点：

糯米和红豆的浸泡：选取优质糯米，置于无油污容器中，清洗2～3次，料水比1∶2（g∶mL），室温浸泡12 h。浸泡后的糯米用手指一捻即碎，若米粒不捻已碎则说明浸泡时间过长，相反若有白心则说明浸泡时间不够[12]。选取色泽暗红且有光泽的优质红豆，洗净后按料水比1∶2（g∶mL）室温浸泡14～16 h[13-14]。

玫瑰花的处理[15]：选择当年产制的颜色鲜亮、香气芬芳浓郁的干花蕾，冷水冲洗后用200 mL沸水冲泡，保温30 min，打浆备用。

蒸饭：将浸泡后的糯米和红豆混合均匀，用蒸锅常压蒸米30 min，要求米粒膨胀糊化，内无白心，松散柔软，但不粘黏成团[12]。

淋冷：将蒸煮好的糯米和红豆用1 L无菌蒸馏水淋冷至30 ℃左右。

混合、拌曲、搭窝：按照料液比1∶1（g∶mL）加入无菌蒸馏水，加入玫瑰花浆、甜酒曲，充分混匀，装入5 L发酵罐，中间挖一个倒喇叭形圆窝，用保鲜膜封口[12]。

发酵：将发酵罐置于30 ℃恒温培养箱发酵，直至中间圆窝中流出酒液并渐渐没过原料。

过滤、灭菌：醪液用双层无菌尼龙布过滤，分装至180mL无菌玻璃瓶，巴氏灭菌（65 ℃、30 min）[15]，冷却后即为玫瑰红豆复合米酒成品。

1.3.2 玫瑰红豆复合米酒发酵工艺优化

（1）单因素试验

按照1.3.1的操作流程和要点，以还原糖含量、总酸含量、酒精度及感官评分为评价指标，在糯米质量为2 kg、玫瑰花添加量为糯米质量的1.0%、红豆添加量为5.0%、酒曲添加量0.3%及30 ℃发酵48 h的基础条件下，每次只改变4个因素中的1个因素，保持其他因素不变，分别考察酒曲添加量（0.1%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%）、发酵时间（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）、玫瑰花添加量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）、红豆添加量（5.0%、10.0%、15.0%、20.0%、30.0%）对复合米酒品质的影响。

（2）响应面试验

在单因素试验结果的基础上，依据Box-Behnken中心组合试验原理设计各因素和水平[15-17]。以酒曲添加量（A），发酵时间（B），玫瑰花添加量（C）及红豆添加量（D）为影响因素，玫瑰红豆复合米酒感官评分（Y）为响应值，利用响应面法优化发酵工艺。Box-Behnken试验设计因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.3 分析检测

酒精度测定：按照国标GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》[18]；还原糖测定：按照国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]；总酸测定：按照国标GB 12456—2008《食品中总酸的测定》[20]；大肠杆菌数测定：按照国标GB/T 4789.3—2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》[21]；菌落总数测定：按照国标GB/T 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》[22]。

感官评价：由10名三级品酒师组成的评定小组从外观、香气、滋味、风格等4个方面进行感官综合评定，满分100分。参考农业行业标准NY/T 1885—2010《绿色食品米酒》[23]建立玫瑰红豆复合米酒感官评分标准见表2。

表2 玫瑰红豆复合米酒感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of rose and red bean compound rice wine

2 结果与分析

2.1 玫瑰红豆复合米酒发酵工艺优化单因素试验

2.1.1 酒曲添加量对玫瑰红豆复合米酒品质的影响

由图1可知，随着酒曲添加量的增多，酒液还原糖先上升，在酒曲添加量为0.6%后趋于平缓，说明酒曲添加0.6%就足以使淀粉转化完全。酒曲添加量＞0.6%之后，酒精度和总酸升高，说明酒曲中的根霉菌将原料中的淀粉转化为可发酵性糖，给酵母菌提供了能量来源，大量的根霉消耗环境中的氧气，为酵母菌的生长提供了条件[4，24]。感官评定结果显示，随着酒曲添加量增多，感官评分先升高后降低，可能是由于随着酒曲量增大，发酵速度加快，乙醇、有机酸等风味物质增多，酒体风味饱满；但酒曲量过多时，酒体酸甜比例失调，苦味突出[11，25]。酒曲添加量为0.6%时，米酒醇香浓郁，酸甜比例恰当，感官评分最高，为83.5分。因此，选择最适酒曲添加量为0.6%。

图1 酒曲添加量对玫瑰红豆复合米酒品质的影响Fig.1 Effect of Jiuqu addition on the quality of rose and red bean compound rice wine

2.1.2 发酵时间对玫瑰红豆复合米酒品质的影响

由图2可知，当发酵时间为24～48 h，酒曲中的根霉菌产生大量的淀粉酶和糖化酶，将糊化后的淀粉转化为可发酵性糖[25-28]；还原糖含量持续升高，酵母菌快速繁殖，酒精度和总酸含量随之增多[27-29]，感官评分升高。发酵时间＞48 h之后，还原糖含量下降，酵母菌等有益微生物利用还原糖产生乙醇、有机酸等酒体风味物质；在发酵时间为60 h时，酒体酒精度达到3.45% vol，感官评分最高，为88.9分。在发酵时间为72 h时，酒精度持续升高，酒味刺鼻，玫瑰花和红豆的风味被掩盖，且酸度增高，酸甜失调。因此，选择最适发酵时间为60 h。

图2 发酵时间对玫瑰红豆复合米酒品质的影响Fig.2 Effect of fermentation time on the quality of rose and red bean compound rice wine

2.1.3 玫瑰花添加量对玫瑰红豆复合米酒品质的影响由图3可知，随着玫瑰花添加量的增多，米酒的还原糖含量、总酸含量和酒精度并未发生明显变化。而感官评分结果显示，随着玫瑰花添加量的增多，复合米酒感官评分先升高后降低，在玫瑰花添加量为2.0%时，感官评分最高，为82.3分。原因可能是：玫瑰花过少时，米酒中花香不明显，颜色偏淡；玫瑰花过多时，米酒花香太重，掩盖了米酒的酒香和红豆的甜香，口感略带苦涩。因此，选择最适玫瑰花添加量为2.0%。

图3 玫瑰花添加量对玫瑰红豆复合米酒品质的影响Fig.3 Effect of rose flower addition on the quality of rose and red bean compound rice wine

2.1.4 红豆添加量对玫瑰红豆复合米酒品质的影响

由图4可知，随着红豆添加量增多，还原糖整体小幅度升高，总酸含量和酒精度变化不明显。这可能是因为添加红豆时带入了淀粉，但短时间内这些淀粉对酒体酒精度影响不大。感官评定结果显示，随着红豆添加量增多，复合米酒感官综合评分先升高后降低，在红豆添加量为15.0%时，感官评分最高，为82.3分。因此，选择红豆最适添加量为15.0%。

图4 红豆添加量对玫瑰红豆米酒品质的影响Fig.4 Effect of red bean addition on the quality of rose and red bean compound rice wine

2.2 玫瑰红豆复合米酒发酵工艺优化响应面试验

2.2.1 Box-Behnken试验设计与结果

基于单因素试验结果，本试验以酒曲添加量（A）、发酵时间（B）、玫瑰花添加量（C）及红豆添加量（D）为影响因素，感官评分（Y）为响应值，运用响应面试验设计优化玫瑰红豆复合米酒发酵工艺。Box-Behnken中心组合试验设计及结果见表3。

表3 Box-Behnken试验设计结果Table 3 Results of Box-Behnken experiments design

2.2.2 响应面试验方差分析

借助Design Expert 8.0.6软件，对试验表3的数据进行回归模型方差分析，结果见表4。以玫瑰红豆米酒感官分析为响应值，得到多元二次回归方程如下：

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，该优化拟合回归模型P值＜0.000 1，模型极显著，失拟项P值=0.067 1＞0.05，失拟项不显著，说明该模型与试验结果拟合程度较好，可以通过该模型确定玫瑰红豆复合米酒的最佳发酵工艺。模型的决定系数R2=0.939 3，校正决定系数R2adj=0.878 7，变异系数（coefficient of variation，CV）=7.45%，说明该模型能解释87.87%响应值的变化。分析各因素P值可知，一次项A、C、D、二次项A2、B2、C2、D2对玫瑰红豆复合米酒的感官评分影响极显著（P＜0.01），一次项B、交互项AB、BC、BD、CD对玫瑰米酒感官评分影响显著（P＜0.05）。分析F值可知，影响玫瑰红豆复合米酒感官评分的因素顺序为：A酒曲添加量＞D红豆添加量＞C玫瑰花添加量＞B发酵时间。

2.2.3 响应面试验分析各因素交互影响

响应曲面和等高线是各因素对响应值影响的直观反映[29]，从响应曲面的坡度可以看出其影响的显著性，从等高线的形状可以看出两因素的交互关系[30]。各因素间的交互作用对玫瑰红豆米酒感官评分影响的响应面及等高线见图5。

图5 各因素交互作用对玫瑰红豆米酒感官评分影响的响应面及等高线Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the sensory score of rose and red bean compound rice wine

由图5可知，酒曲添加量和发酵时间、发酵时间和玫瑰花添加量、发酵时间和红豆添加量、玫瑰花添加量和红豆添加量之间交互作用对玫瑰红豆米酒的感官评分有显著影响（P＜0.05），这与表4的方差分析结果一致。

2.3 玫瑰红豆复合米酒工艺优化验证试验

通过响应面试验最大值预测，得出玫瑰红豆复合米酒最佳发酵工艺条件为：酒曲添加量0.50%，发酵时间60.34 h，玫瑰花添加量1.76%，红豆添加量14.07%。此发酵工艺条件下模型预测玫瑰红豆复合米酒感官评分理论值为94.77分。根据模型预测结果，结合实际操作的可行性，最佳发酵条件修正为：酒曲添加量为0.5%，发酵时间为60 h，玫瑰花添加量为1.8%，红豆添加量为14.0%。在此条件下进行3次平行验证试验，玫瑰红豆复合米酒感官评分实际值为94.10分，与理论值94.77分基本接近，因此该模型预测结果比较可靠。

2.4 玫瑰红豆复合米酒的指标测定

经检测，最佳发酵工艺条件下生产的玫瑰红豆米酒的酒精度为3.27% vol，还原糖含量为31.54 g/100 mL，总酸含量为7.95g/L，菌落总数＜50CFU/mL；大肠杆菌＜3MPN/100g。

3 结论

本试验以富含花青素的玫瑰花和有行气补血功效的红豆以及糯米为原料，研制了一款香味协调的复合米酒。基于单因素试验结果，采用响应面法优化工艺，得到玫瑰红豆复合米酒的最佳发酵工艺：糯米中添加14.0%的红豆，常压蒸煮糊化，再添加1.8%玫瑰花和0.5%甜酒曲，拌和均匀，30 ℃恒温发酵60 h。在此条件下得到的复合米酒均匀无沉淀，香气芬芳雅致，口感清甜爽口，风格独特，感官评分为94.1分。此产品为传统米酒增添了新口感，为新型米酒的开发提供了参考。