CRISPR/Cas9技术在作物遗传育种中的应用进展

焦耀磊，王春生，曲 硕，孙珊珊，朱婷婷，赵 贺，王丕武

（1.吉林农业大学 农学院，吉林 长春 130118；2.吉林农业大学 园艺学院，吉林 长春 130118）

近几十年，世界人口数量大幅增长，粮食产量供给不足成为当代人面临的一大问题[1-2]。影响农作物产量的因素除了耕地面积外，还有自然环境，包括非生物胁迫（干旱、高盐、低温、高温等）和生物胁迫（真菌、细菌、病害、虫害等），其中病害导致农作物产量下降10%～15%[3]。CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISRP-associated nuclease 9）技术是近几年发展起来的第3代基因组编辑技术，它是一种能够研究基因功能并且提高作物产量的手段[4-5]，从在植物上第一次应用至今近10 a时间，研究人员利用该技术在植物领域进行了大量研究工作。目前，基因组编辑技术共出现了3代。第1代基因组编辑技术是ZFNs（Zinc finger nucleases）[6-8]，优点是可与细胞内DNA修复机制共同发挥作用，使研究者自如地编辑基因组，具有高度特异性，因而避免了免疫应答；缺点是需要组装复杂的蛋白质序列，导致构建难度较大，并且容易发生脱靶现象、导致细胞死亡。第2代基因组编辑技术是TALENs（Transcription activator like effector nucleases）[9-12]，优点是在很大程度上避免了脱靶现象，构建复杂蛋白质序列时较第一代技术简单，缺点是该技术易受环境影响。第3代基因组编辑技术是CRISPR/Cas9，与前2代技术相比，优点是仅需设计和构建几十个碱基的CRISPRRNA序列即可，用时更少且简便、突变效率高；缺点是易发生脱靶现象，而且靶突变验证难度高，目前该技术已被应用于多种生物的基因组定向编辑[13-16]。综述了CRISPR/Cas9系统的结构、分类、作用机制及在作物遗传改良中的应用进展，并探讨了其存在的问题，展望了其应用前景。

1 CRISPR/Cas系统介绍

1.1 CRISPR/Cas9系统的发展史

20世纪80年代末，日本科学家ISHINO发现大肠杆菌基因组中碱性磷酸酶同工酶基因IAP上游存在一系列间隔的重复序列[17]。研究人员对大肠杆菌进行基因组测序，发现许多单拷贝的前导序列和多拷贝的短序列。随后，有更多的相似位点在细菌和古细菌中被测出[18]。多位科学家认为，该结构能在DNA修复和基因调控中起作用[19-20]。2002年，JANSEN等[21]在细菌与古细菌中发现了新的重复序列家族，该重复序列结构特点为25～37 bp的序列片段与非重复的间隔序列交替出现，因为核苷酸序列与片段大小在同一物种内高度保守，种间则无相似性，JANSEN依照此结构将其命名为成簇的规律性间隔短回文重复序列，即CRISPR。2005年，BOLOTIN[22]发现，CRISPR中的这些短序列来自病毒和质粒，对CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白结构进行分析，发现其具有核酸酶和解旋酶活性[23-24]。随后人们通过研究发现，CRISPR/Cas系统是存在于细菌和古细菌中的一种适应性免疫系统[25]。2007年，BARRANGOU等[26]通过对嗜热链球菌进行试验进一步证实了CRISPR/Cas系统的适应性免疫过程，噬菌体侵染细菌后，细菌会从噬菌体基因组中将一段序列整合进自身基因组成为新的间隔序列，形成了特异性抵抗噬菌体的表型。2012年，成熟的crRNA（CRISPR RNA）被鉴定为与Cas蛋白相关的引导序列，有助于细菌对外源DNA的抵抗[27]。2013年，CONG等[28]使用人工设计的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统成功诱导人和小鼠基因组的靶向切割，证实了RNA引导的CRISPR/Cas9技术具有广泛适应性。ANDRIY等[29]利用CRISPR/Cas9技术在双RNA复合物的引导下成功对肺炎双球菌和大肠杆菌基因组进行定点突变，证明了该技术在细菌基因组中进行编辑的可行性。

1.2 CRISPR/Cas系统的分类

CRISPR/Cas系统中Cas核酸酶能够通过引导RNA（Guide RNA，gRNA）的协助定点编辑基因组DNA。Cas蛋白作为一种核酸酶能够在gRNA与外源DNA序列互补后定点切割外源基因序列。多项研究结果表明，CRISPR/Cas系统的成熟是通过产生种类不同的Cas蛋白来实现的[30]。MAKAROVA等[31]根据Cas蛋白的类别将CRISPR/Cas系统划分为3种类型。Ⅰ型系统包括6个Cas蛋白，其中以Cas3蛋白为标志性蛋白质。Cas3蛋白包含SF2(Superfamily-2)解旋酶结构域和HD(Histidine-aspartate domain)核酸酶结构域，为主要功能蛋白，能促进crRNA的合成，同时能在系统靶向干扰期间行使功能[32]。相较于其他2个类型，Ⅰ型系统Cas蛋白在数量和复杂程度上位居第一。SINKUNAS等[33]以嗜热链球菌为材料，发现Cas3蛋白能够凭借其HD结构域优先选择单链DNA为作用底物。另外，Cas3蛋白HD结构域的核酸酶活性是非ATP依赖性的，在对外源DNA切割时具有促进作用。Ⅱ型CRISPR/Cas系统以Cas9蛋白为主[34]。Cas9蛋白参与crRNA的合成[35]，含有HNH(Histine-asparagine-histine）核酸酶结构域和RuvC(Crossover junction endodeoxyribonuclease）结构域，能够有效降解外源DNA和质粒。HNH核酸酶结构域能够特异性切割外源DNA与间隔序列的互补链，RuvC结构域能够切割另一条链[36-37]。Ⅲ型CRISPR/Cas系统主要存在于古细菌中，大多数在临床分离的致病菌中被发现，该系统以Cas10蛋白为标志性蛋白质，对crRNA成熟起促进作用。3种类型系统各有特点，其中Ⅱ型CRISPR/Cas9系统仅需Cas9蛋白即可起到使外源DNA双链断裂的作用，而且只需要gRNA引导即可发挥功能，而Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas系统需要复杂的蛋白质复合物和多个RNA协助起作用。目前，CRISPR/Cas9系统已被人们改良并应用于多种生物基因组编辑[38]。

1.3 CRISPR/Cas系统的结构及作用机制

细菌与大多数古细菌在漫长的生物演变过程中，已经进化出了由RNA引导的获得性免疫系统，该系统主要由CRISPR位点和与之相关的基因编码，用于抵抗噬菌体侵染和质粒转移[39-41]。

一个典型的CRISPR/Cas系统是由CRISPR基因座和CRISPR相关基因（Cas）以及反式编码RNA（Trans-acting CRISPR RNA,tracrRNA）构成。当噬菌体侵染时，CRISPR/Cas系统的免疫机制分为3个步骤进行。首先，当噬菌体首次侵染时，宿主体内的蛋白质复合体会与外源DNA靶标PAM（Protospacer adjacent motif）进行序列互补，将一小段外源DNA片段（原间隔序列）剪切并整合至宿主细胞CRISPR基因座中作为新的间隔序列保存[42]，从而保存了先前感染的遗传记录，这一过程使宿主能够快速抵抗该入侵者的再次入侵[43]。其次，当噬菌体再次侵染时，新的间隔序列和其他间隔序列共转录成一个pre-crRNA（包含重复序列和间隔序列），tracrRNA也将被单独转录，pre-crRNA在Cas蛋白的催化作用下加工为成熟的crRNA[44]，值得注意的是，不同类型系统中Cas蛋白种类也不同。最后，成熟的crRNA与Cas蛋白将在tracrRNA指导下组装成效应复合物，成熟的crRNA中的间隔序列能与靶DNA序列互补，并引发Cas核酸酶对靶序列的特异性破坏，使得外源DNA功能缺失而失去对宿主的攻击性。CRISPR/Cas系统的一个显著特征是能够识别外源DNA靶标PAM并破坏外源核酸中的互补序列[45-46]。

2 CRISPR/Cas9技术在作物遗传育种中的应用进展

植物为人们提供食物、动物饲料、药品、化学品、可再生材料和生物燃料。人们通过对植物进行培育来获得人们需要的优良性状。常规育种方法依靠现有的自然遗传变异，需要进行长期选育过程，才能将选定的性状渗入到另一个优良的品种中，且选育效果受到自然界中优良等位基因的可用性限制。新的等位基因可以通过随机诱变引入，但具有理想特性的突变体需要对大种群进行大规模的筛选才能确定，而筛选耗时长。因此，可以通过直接引入精确和可预测的基因组修饰来加速植物育种，而CRISPR/Cas9系统功能完备，且可以同时对多个靶位点进行修饰。

NHEJ（Non-homologous end joining）介导的基因敲除是最简单的定向修饰形式，可用于消除对作物品质有负面影响的基因。通过HDR(Homologous directed repair)插入序列，可以在确定的位点引入外源基因，促进高水平转录，且不干扰内源基因的功能。

2.1 CRISPR/Cas9技术在作物品质改良育种中的应用进展

较高的稻米蛋白质含量能够降低其食用口感和蒸煮品质[47-48]。稻米蛋白质含量是一个复杂农艺性状，通过对相关基因的调控，在一定范围内降低蛋白质含量可以改善口感。氨基酸转运体对蛋白质合成有重要作用[49]。WANG等[50]利用CRISPR/Cas9技术对水稻氨基酸转运体基因AAP6(Amino acid transporter gene 6)和AAP10进行靶向敲除，所获突变体的蛋白质含量显著降低，并且直链淀粉含量降低，为培育食用口感和蒸煮品质理想的水稻品种提供了新的策略。醇溶蛋白是大麦中的一种储存蛋白，与麦芽品质负相关。LI等[51]利用CRISPR/Cas9技术对大麦D醇溶蛋白（D hordein）基因进行靶向敲除，共得到2个突变株系，转录组分析表明，突变体的D醇溶蛋白基因转录水平比野生型低，该研究为培育高品质麦芽品种提供依据。

WANG等[52]为研究CRISPR/Cas9技术在块根作物中的应用效果，分别选取淀粉型甘薯品种徐薯22和富含胡萝卜素型的甘薯品种泰中6为研究对象，以2个淀粉合成基因GBSSⅠ(Granule-bound starch synthaseⅠ)和SBEⅡ(Starch branching enzymeⅡ)为靶基因进行靶向敲除，其中GBSSⅠ基因控制直链淀粉的合成，SBEⅡ基因控制支链淀粉的合成，基因突变效率在62%～92%，突变体总淀粉含量无显著变化，但徐薯22和泰中6的GBSSⅠ基因敲除突变体直链淀粉含量均下降，而徐薯22和泰中6的SBEⅡ基因敲除突变体中支链淀粉含量均下降。说明CRISPR/Cas9技术是提高甘薯淀粉品质和选育多倍体块根作物的有效工具。植物脂肪酸成分配比对食用和加工品质有重要影响，因此，对油料作物脂肪酸相关基因进行改造成为育种目标之一。油菜中脂肪酸脱饱和酶基因FAD2(Fatty acid desaturase-2)是影响其油酸、亚油酸和亚麻酸含量的关键基因。HUANG等[53]利用CRISPR/Cas9技术对异源四倍体油菜中BnaFAD2基因的4个拷贝均进行突变，所获突变体与野生型相比，油酸含量显著提升，最高达到80%，亚油酸与亚麻酸含量下降。

2.2 CRISPR/Cas9技术在作物产量提升育种中的应用进展

目前，利用CRISPR/Cas9技术对作物产量性状相关基因进行靶向编辑能够有效提高作物产量。

水稻GS3（Grain size gene 3）和Gn1a（Grain number gene 1a）基因分别控制水稻的籽粒大小和粒数。沈兰等[54]利用CRISPR/Cas9技术对水稻GS3和Gn1a基因进行靶向编辑，使用农杆菌介导法转化4个优质水稻品种，分别获得了GS3和Gn1a的移码突变体，突变体gs3和gn1a与野生型相比粒长变长,千粒质量增加；gs3突变体与gn1a突变体相比,穗粒数显著增加。ZHOU等[55]针对J809、L237和CNXJ 3个优质水稻品种进行产量相关性状基因的QTL定位，发现了与籽粒大小相关的基因GS3、与籽粒长度和质量相关的基因GW2（Grain width and weight gene 2）、与籽粒数量相关的基因Gn1a，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对3个基因进行靶向编辑，水稻品种J809和L237的三重突变体的单穗产量分别增加了68%和30%，CNXJ的三重突变体仅表现为半矮化表型。水稻株高是与产量相关的重要农艺性状，水稻拥有适宜的株高有利于抗倒伏、增加种植密度，进而有利于产量的提高。在水稻中，GA20ox2是编码GA20氧化酶的基因，其功能丧失可降低水稻株高。张笑寒[56]利用CRISPR/Cas9技术对GA20ox2基因进行定点突变，所得突变株与野生型相比，株高显著降低，其他农艺性状未发生变化，这为培育水稻新品种提供了依据。在多倍体油菜育种中，抗碎荚性是影响多倍体油菜产量的重要因素之一。ZAMAN等[57]利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术定向敲除影响油菜荚果形状和大小的JAG（Jagged gene）同源基因JAG.A08，所得突变体与野生型比较，荚果开裂区发生显著变化，突变体荚果细胞变大，果实凹凸不平、体积变小，抗碎荚性提高2倍。

2.3 CRISPR/Cas9技术在作物抗逆育种中的应用进展

通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术对作物抗逆基因进行定向修饰，增强植株对环境的抗性，成为作物抗逆育种的一种有效方式。水稻RR22（B-type response regulator transcription factor 22）基因参与植物细胞分裂素信号转导和代谢过程，该基因功能缺失可显著提高植物耐盐性[58]。ZHANG等[59]利用CRISPR/Cas9技术构建OsRR22基因敲除载体转入水稻中，所得T2突变株与野生型相比，苗期耐盐性显著提高。LIU等[60]从番茄中鉴定出1个LBDⅡ（Lateral organ boundaries domainⅡ）型基因家族LBD40（Lateral organ boundaries domain gene 40）基因，该基因能在植物根和果实中高表达，在PEG和高盐的诱导下高表达，利用CRISPR/Cas9技术靶向敲除番茄LBD40基因，获得突变体，干旱胁迫处理后，与野生型比较，突变体的保水能力提高。

白叶枯病是影响水稻生产的严重病害之一，由黄单胞杆菌变种引发，能使水稻减产50%。郝巍[61]对水稻转录组进行测序，发现1个易感白叶枯病的基因HW3（Rice bacterial blight susceptible gene），利 用CRISPR/Cas9技术构建HW3基因敲除载体，通过农杆菌介导法转入水稻中，对转基因阳性植株进行水稻白叶枯病菌株PXO99A的接菌处理，最终得到4株对PXO99A表现抗性的植株，说明通过敲除水稻感病基因HW3可提高感病品种对白叶枯病的抗病性。稻瘟病作为水稻最具破坏性的病害之一，常造成水稻大量减产。水稻ERF922（Ethylene-responsive factor gene 922）基因能够调控水稻对稻瘟病的抗性。WANG等[62]利用CRISPR/Cas9技术对ERF922基因进行靶向敲除，所得突变植株表现出抗稻瘟病性，经过纯合加代后培育出抗稻瘟病品系。

2.4 CRISPR/Cas9技术在作物雄性不育性材料选育中的应用进展

雄性不育突变体和不育基因是作物杂交育种的珍贵资源。发展杂交制种技术，必须建立新的雄性不育突变系。CRISPR/Cas9技术非常适合针对基因组进行靶向修饰，从而产生雄性不育突变体。

LI等[63]利用TaU3(Triticum estivumRNA polymeraseⅢpromoters U3)启动子驱动优化后的CRISPR/Cas9载体，定点编辑3个小麦氧化还原酶同源等位基因NP1(No pollen 1)，得到完全雄性不育的突变体。刘玉琛等[64]利用CRISPR/Cas9技术对番茄花器官调控基因AP3(APETALA 3)进行突变，对所得阳性突变株进行测序，发现PAM序列上游存在核苷酸缺失现象，该现象可能导致AP3基因编码蛋白质出现氨基酸缺失和基因表达提前终止情况；对突变株农艺性状进行观察，发现与野生型相比，突变株花瓣器官转变成类似萼片的结构，原本雄蕊的位置被类似心皮的结构替代。SHEN等[65]利用CRISPR/Cas9技术对水稻雄性不育基因PTGMS2-2（Photoperiod-thermo-sensitive genic male sterile gene 2-2）进行靶向修饰，得到了光周期/热敏核不育系。CHEN等[66]构建CRISPR/Cas9载体用于靶向敲除玉米MS8（Male sterility gene 8）基因，所得突变株获得雄性不育表型，且突变基因符合孟德尔遗传规律，可稳定传递到子代。

3 CRISPR/Cas9技术存在的问题及前景

3.1 问题

在过去的几年里CRISPR/Cas9基因组编辑技术已经取得了很大的进步，但该技术仍存在一些未完全解决的问题，如脱靶现象、外源基因残留等。

3.1.1 脱靶问题 与ZFNs和TALENs基因组编辑技术相比，依赖于gRNA的CRISPR/Cas9技术在特异性识别方面更具有优势，但由于其编辑对象的基因组碱基数目庞大，相似片段也会广泛存在，gRNA可能会识别靶点DNA以外的相似片段，进而会导致Cas9核酸酶对基因组的错误切割，引发脱靶现象。这种非特异性的基因组编辑易对编辑对象的生物学反应造成不确定性，影响该技术在研究和实践中的可靠性。

3.1.2 外源基因残留问题 从CRISPR/Cas9技术开发至今，针对植物基因组编辑的常规方法是构建含有gRNA和Cas9蛋白基因序列的载体，然后通过农杆菌介导等方法转入受体，获得基因组编辑突变植株，之后可经过杂交或自交等方法剔除多余的外源基因。但质粒在降解过程中可能会有未完全降解的小片段留在植物体内，导致外源基因残留。

3.2 前景

目前，研究人员针对脱靶现象不断改进该技术，使其降低脱靶率，解决外源基因残留问题。由于CRISPR/Cas9技术具有简单、高效等优势，所以该技术依然具有广泛应用于多种生物基因组编辑的前景。

CRISPR/Cas9系统虽然是一个非常好的基因组编辑工具，但需要更详细地研究脱靶突变的程度，以及不同但完全匹配的靶点之间的切割效率差异。研究人员可同时生产并测试多种gRNA，并且大力发展新一代测序技术，这将为比较CRISPR/Cas9技术在多个物种和不同细胞类型中的应用效果提供充足的依据。此外，分析Cas9蛋白的结构及其与gRNA和目标DNA的相互作用将促进更高效和特异性的新型核酸酶的开发。通过对Cas9蛋白的深入研究，研究人员开发出需要更长PAM的Cas9蛋白（更长的PAM在基因组中出现率更低），这可能会进一步减少脱靶效应。每一个涉及宿主-病原体相互作用的进化过程都是一场通过适应对手并产生新的对抗机制来战胜对手的军备竞赛。因此，一些病毒很可能已经进化出了能够抵抗细菌免疫系统的调控因子，而这些尚未被发现的调控因子可能对病毒抵抗细菌CRISPR/Cas9系统提供帮助。