厚朴酚联合吉非替尼对A549非小细胞肺癌细胞的干预作用*

任吉莲, 崔灵芝, 郝小夏, 李晓颜, 常彦祥

(1. 山西医科大学汾阳学院医学检验系， 汾阳 032200； 2. 山西省肿瘤医院干部诊疗科， 太原 030013； 3. 山西省汾阳医院检验科，汾阳 032200； 4. 西安医学院第一附属医院， 陕西 西安 710077)

肺癌是最常见的恶性肿瘤，造成全球最多的肿瘤相关死亡人数，其中非小细胞肺癌(nonsmall-cell lung carcinoma，NSCLC)在肺癌中占比最大[1]。当前较为有效的疗法包括新一代化疗药如多西他赛[2]，以及表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)，如吉非替尼(Gefitinib)等[3, 4]，均展示了明显的非小细胞肺癌患者的治疗效果。虽然TKIs的治疗已经取得了显著的效果，但肿瘤最终复发的原因是由于EGFR突变而出现了对TKIs的获得性耐药[5]。除了EGFR突变外，现在发现单用EGFR-TKI很容易导致包括NSCLC在内的肿瘤干细胞增多[6]。因此，针对NSCLC的肿瘤干细胞样特性制定用于EGFR-TKI辅助治的、可以克服耐药性的策略，对于改善预后和提高未来生存具有重要意义[7]。

厚朴是传统中药，常用于治疗肠胃紊乱、焦虑、咳嗽、急性疼痛和过敏性疾病。厚朴酚(Magnolol)是从厚朴树的根和茎的树皮中分离得到的羟基联苯。厚朴酚具有包括抗肿瘤等的广泛的生物活性。厚朴酚具有良好的安全性，可以减少肿瘤生长，诱导细胞凋亡，抑制侵袭和转移[8]。然而，鲜有报道厚朴酚对肿瘤干细胞样特性的影响。本研究重点关注厚朴酚对非小细胞肺癌A549细胞干细胞样特性的影响及其与吉非替尼的交互影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

人非小细胞肺癌A549细胞购自武汉Procell公司；厚朴酚(M3445)和吉非替尼(SML1657)购自Sigma；CCK-8试剂盒、10% SDS-PAGE、PVDF膜、羊抗兔IgG-HRP、ECL化学发光检测试剂盒、Giemsa染色液、胰蛋白酶、碘化丙啶、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自北京Solarbio公司；Western Blot抗体增殖标记蛋白Ki67(1∶1 000)、增殖和核原蛋白(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)(1∶1 000)、B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma 2, Bcl-2) (1∶1 000)、Bcl-2相关X调往调节蛋白(Bcl-2 associated X apoptosis regulator, Bax)(1∶1 000)、性别决定区Y- 盒2(Sex determining region Y-box 2, SOX2)(1∶1 000)、八聚体结合转录因子4 (Octamer-binding transcription factor 4 OCT4)(1∶1 000)、actin(1∶1 000)购自美国CST公司；10 mg/mL RnaseA购自上海翊圣生物科技有限公司；流式抗体CD44、CD133购自英国Abcam公司。Multiskan FC酶标仪购自美国Thermo Fisher公司；FACSAria II流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 实验分组及处理

除了克隆形成实验，处理时间为24 h。对于CCK-8实验，配制500 μmol/L厚朴酚，分别取100 μl、80 μl、60 μl、40 μl、20 μl、10 μl、5 μl及1.25 μl(取四倍体积于单个边缘孔，加入培养基至400 μl)，分配于每个浓度的4个复孔。配制100 μmol/L吉非替尼，二倍稀释法稀释直至0.625 μmol/L组(每个浓度4个复孔)。CCK-8以加入1 μl PBS的培养基为对照。对于其他实验，采用对照组、厚朴酚组、吉非替尼组和厚朴酚+吉非替尼组的析因分析设计。对照组加正常培养基，厚朴酚浓度为100 μmol/L、吉非替尼浓度5 μmol/L，共处理组同时加入两药。

1.3 CCK-8实验

根据制造商的操作说明，使用CCK-8试剂盒检测A549细胞的活力。将细胞接种至96孔板，厚朴酚及吉非替尼分别处理上述细胞，在37℃ 5% CO2条件下培养24 h。将10 μl CCK-8溶液添加至上述孔中，再培养2 h。用酶标仪检测每个孔在450 nm处的吸光度。实验重复3次。

1.4 克隆形成实验

将A549细胞接种于6孔板中，每孔200个细胞，加药后连续培养7 d。废弃培养基，每个孔用PBS仔细洗两次。将菌落在甲醇中固定20 min，然后用Giemsa染色液染色。统计≥50个细胞的菌落数，计算菌落形成效率(菌落百分比=菌落形成数/接种细胞数×100%)。

1.5 蛋白印迹实验

用10% SDS-PAGE分离细胞和肿瘤中的蛋白，并转移到PVDF膜上。在被5%脱脂牛奶封闭后，蛋白质与第一抗体在4℃下孵育过夜。主要抗体如下：Ki67(1∶1 000)、PCNA(1∶1 000)、Bax(1∶ 1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、SOX(1∶1 000)、OCT4(1∶1 000)、actin(1∶1 000)。PBS洗涤，羊抗兔IgG-HRP孵育1 h。用ECL化学发光检测试剂盒观察这些条带。

1.6 流式细胞术

用胰蛋白酶消化A549细胞，用70%乙醇在4℃下过夜固定细胞。然后加入10 mg/ml RnaseA和碘化丙啶于4℃染色过夜。使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)按照说明书使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。AnnexinV-FITC(-) / PI(-)(左下)为正常细胞，AnnexinV-FITC (+) / PI(-)细胞(右下)为早期凋亡细胞，AnnexinV-FITC (+) / PI(+)(右上)为晚期凋亡细胞。AnnexinV(-)/ PI(+)(左上)为坏死细胞。所有实验重复3次。

将1×106个细胞加入在PBS中，添加100 μl 1% 胎牛血清、1 μg CD16/CD32，放置冰上孵育30 min用于阻断非特异性Fc相互作用，然后用PE-CD133, FITC-CD44和eFluor 660- ESA 抗体标记1 h。标记后的细胞在1%胎牛血清的PBS中重悬，用流式细胞仪分析。同型IgG和未染色细胞作为阴性对照。使用相同的设置，利用流式细胞仪对CD44和CD133标记的A549细胞进行分选，获得CD133+CD44-和CD133-CD44+亚群。PI(1 μg/ml)添加到细胞悬液排除分选中的死细胞。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 厚朴酚和吉非替尼对非小细胞肺癌A549细胞活力的影响

CCK-8检测细胞活力。如图1A所示，厚朴酚100 μmol/L以下对细胞活力无显著影响，而100 μmol/L以上浓度的厚朴酚组细胞活力现在降低(P<0.05)。如图1B所示，5 μmol/L以下浓度的吉非替尼组细胞活力无显著变化，而10 μmol/L以上吉非替尼组细胞活力现在降低(P<0.05)。因此，选取100 μmol/L厚朴酚和5 μmol/L吉非替尼进行后续实验。

Fig. 1 Effects of magnolol and gefitinib on the viability of A549 cells (n=3)A: The viability of A549 cells treated with magnolol; B: The viability of A549 cells treated with gefitinib*P<0.05 vs control group

2.2 厚朴酚和吉非替尼对非小细胞肺癌A549细胞增殖的影响

克隆形成实验检测增殖情况。如图2A所示，与对照组比较，厚朴酚组与吉非替尼组的克隆形成率显著降低(P<0.05)；与吉非替尼组比较，厚朴酚+吉非替尼组的克隆形成率显著降低(P<0.05)。Western Blot检测增殖相关蛋白表达。如图2B所示，与对照组比较，厚朴酚组与吉非替尼组的Ki67和PCNA蛋白表达显著下调(P<0.05)；与吉非替尼组比较，厚朴酚+吉非替尼组的Ki67和PCNA蛋白表达显著下调(P<0.05)。上述实验表明，厚朴酚可协同吉非替尼抑制A549细胞增殖，且厚朴酚与吉非替尼存在交互作用(P<0.05)。

Fig. 2 Effects ofmagnolol and gefitinib on proliferation of A549 cells in non-small cell lung cancer (n=3)A: The cloning formation rate was measured by cloning formation assay; B: The expression levels of proliferation-related proteins were detected by Western blot*P<0.05 vs control group

2.3 厚朴酚和吉非替尼对非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响

流式细胞术检测凋亡情况。如图3A所示，与对照组比较，厚朴酚组与吉非替尼组的细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与吉非替尼组比较，厚朴酚+吉非替尼组的克隆形成率显著升高(P<0.05)。Western blot检测凋亡相关蛋白表达。如图3B所示，与对照组比较，厚朴酚组与吉非替尼组的Bax/Bcl-2蛋白表达比例显著上调(P<0.05)；与吉非替尼组比较，厚朴酚+吉非替尼组的Bax/Bcl-2蛋白表达比例显著上调(P<0.05)。厚朴酚可协同吉非替尼促进A549细胞凋亡，且厚朴酚与吉非替尼存在交互作用(P<0.05)。

Fig. 3 Effects ofmagnolol and gefitinib on apoptosis of A549 cells in non-small cell lung cancer (n=3)A: The cell apoptosis rate was measured by cytometry; B: The expression levels of apoptosis-related proteins were detected by Western blot*P<0.05 vs control group

2.4 厚朴酚和吉非替尼对非小细胞肺癌A549细胞干细胞标记物表达的影响

Western blot检测干细胞标记蛋白表达。如图4A和4B所示，与对照组比较，厚朴酚组与吉非替尼组的SOX2和OCT4蛋白表达显著下调(P<0.05)；与吉非替尼组比较，厚朴酚+吉非替尼组的SOX2和OCT4蛋白表达显著下调(P<0.05)。上述实验表明，厚朴酚可协同吉非替尼抑制A549细胞干细胞特性，且厚朴酚与吉非替尼存在交互作用(P<0.05)。

Fig. 4 Effects ofmagnolol and gefitinib on stem cell markers of A549 cells in non-small cell lung cancer (n=3)A: The expression levels of stem cell marker proteins were detected by Western blot; B: The statistical graph of Western blot*P<0.05 vs control group

2.5 厚朴酚和吉非替尼对非小细胞肺癌A549细胞干细胞阳性细胞数的影响

流式细胞术检测干细胞阳性细胞数量。如图5A和5B所示，与对照组比较，厚朴酚组与吉非替尼组的CD44+和CD133+细胞数量显著减少(P< 0.05)；与吉非替尼组比较，厚朴酚+吉非替尼组的CD44+和CD133+细胞数量显著减少(P<0.05)。上述实验表明，二者协同抑制干细胞样特性，且厚朴酚与吉非替尼存在交互作用(P<0.05)。

3 讨论

厚朴酚可抑制肺癌细胞增殖，降低肿瘤生长、侵袭和转移。非小细胞肺癌细胞株经厚朴酚处理后导致细胞凋亡。此外，它还有助于AIF的核转位、内切酶G的激活和PARP的裂解[9]。体外对A549和H1299细胞的研究表明，厚朴酚在G0/G1期引起细胞周期阻滞，同时上调促凋亡蛋白的表达。此外，A549异种移植瘤模型体内，通过表观遗传激活DR5，进而激活死亡受体介导的细胞凋亡，从而抑制肿瘤生长和诱导细胞凋亡[10]。对A549体外研究证实，厚朴酚通过抑制微管聚合导致细胞周期在有丝分裂期停止，而厚朴酚对A549肿瘤异种移植模型的研究中，肿瘤生长抑制[11]。本研究的结果与之前的报道一致，厚朴酚抑制了A549细胞增殖，抑制细胞凋亡，而且，厚朴酚抑制SOX2和OCT4蛋白，减少了CD44+和CD133+细胞数量，进而抑制了A549干细胞特性。

对细胞干性的调控可能是厚朴酚的潜在功能。如厚朴酚通过线粒体诱导活性氧和凋亡、激活mTOR相关自噬从而抑制小鼠胚胎干细胞的胚状体分化[12]。我们发现，厚朴酚能一定程度的减少感性标志物表达，降低感性标志物表达的细胞占比，与吉非替尼共用能更为显著的抑制A549 的干性，且吉非替尼和厚朴酚具有交互作用。我们的研究支持厚朴酚或许能用来对抗吉非替尼治疗中肿瘤干细胞增加的对策性辅助疗法。

天然化合物可从细胞毒性、免疫增强和辅助治疗等方面发挥抗癌作用。如芹菜多糖增强荷瘤小鼠对肺癌细胞的免疫反应[13]；葛根素可以直接诱导A549细胞凋亡[14]；又如丹参酮IIA通过调控VEGFR/Akt通路逆转人非小细胞肺癌中的吉非替尼耐药[15]。类似地，本研究发现，厚朴酚强化了吉非替尼对A549细胞的抗增殖、促凋亡及减弱干细胞样特性的作用，表明厚朴酚增强了A549细胞对吉非替尼的敏感。

综上所述，厚朴酚可与吉非替尼协同作用，抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖，促进其凋亡。具体机制可能是通过抑制A549的干细胞样特性。