结肠癌中NCAPD2蛋白过表达的临床病理特征及预后意义

于 博，刘 颖,2，徐 然,2，白丽娜,2，冯麟媛,2，杨 洋,2

结肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率及病死率均较高[1-2]。近年，我国结肠癌的发病率和病死率均呈上升趋势，且超过60%的患者在确诊时已为晚期，5年生存率不足13%，预后差[3-4]。因此，临床亟待寻找结肠癌的早期识别及预后评估的生物学标志物，以提升患者的早期诊断率，延长患者的生存期。NCAPD2从属于染色体凝缩蛋白复合物I，是非SMC亚单位的亚基之一，主要参与染色质有丝分裂的正常分离和凝缩过程[5]。已有多项研究显示，凝缩蛋白复合物亚基的功能异常缺失/获得参与癌症的发生、发展。其中，在SMC亚单位中SMC2基因的异常改变可能与胃癌和结直肠癌的发生密切相关[6]；其同属的SMC4基因也在结直肠癌和肝癌中与细胞周期进程密切相关[7]；同样非SMC亚单位NCAPH在结直肠癌组织中表达上调，并可作为一种预后评估标志物[8]。目前，尚无文献报道证实NCAPD2与结肠癌患者预后之间的关系。本文采用免疫组化SP法检测NCAPD2在结肠癌组织中的表达及其与临床病理特征、预后评估之间的关系，探讨NCAPD2蛋白对结肠癌患者预后的临床价值。

1 材料与方法

1.1 材料组织芯片购自上海芯超生物公司，组织芯片标本180例，其中包括86例癌旁正常组织和94例结肠癌组织。94例结肠癌患者男性48例，女性46例；年龄范围27～90岁；肿瘤直径：≤4 cm者34例，>4 cm者60例；病理分级：Ⅰ级19例，Ⅱ级60例，Ⅲ级15例；T分期：T1+T2者11例，T3+T4者83例；临床分期：Ⅰ+Ⅱ期58例，Ⅲ+Ⅳ期36例；有淋巴结转移者34例，无淋巴结转移者60例。

1.2 主要试剂NCAPD2兔抗人单克隆抗体购自美国Abcam公司，免疫组化SP两步法试剂盒购于北京中杉金桥公司。

1.3 免疫组化标本均经10%中性福尔马林固定，常规脱水，透明，浸蜡，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，行免疫组化SP两步法染色。其中，免疫组化染色步骤参照本组前期实验[9]，主要包括：组织切片常规烤片脱蜡水化抗原热修复，滴加一抗4 ℃孵育过夜后滴加二抗孵育45 min，DAB显色，苏木精对比染色，中性树胶封固。选择NCAPD2蛋白强阳性染色的切片作为阳性对照，选择以PBS代替一抗的染色结果作为阴性对照。

1.4 评定标准根据Beesley分级法，以细胞质和细胞核中出现棕褐色颗粒的比例作为判定NCAPD2蛋白阳性染色的标准。根据阳性细胞百分比计分：阳性细胞数占0～5%为(-)，6%～25%为(+)，26%～50%为()，51%～75%为()。其中“+～”为阳性，“”为强阳性。

1.5 生信分析采用TIMER数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)检索NCAPD2基因在多种肿瘤中的差异表达；应用UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析结肠癌组织和正常黏膜组织中NCAPD2 mRNA的表达及其与临床病理特征的关系；应用GEO(Gene Expression Omnibus)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/)分析在正常结肠黏膜组织、结肠癌组织和转移性结肠癌组织中NCAPD2 mRNA的表达水平。

1.6 统计学分析应用SPSS 25.0和GraphPad Prism 7.0软件进行统计学分析，采用χ2检验或Fisher精确检验法分析NCAPD2表达与临床病理特征的相关性；采用t检验分析NCAPD2 mRNA表达与肿瘤分期和淋巴结转移之间的关系；采用Kaplan-Meier生存曲线和Log-rank检验进行生存分析；Cox回归模型进行单因素和多因素预后分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织中NCAPD2 mRNA的表达通过TIMER数据库检索发现，NCAPD2基因在多种恶性肿瘤组织中表达上调，其在结肠癌组织中mRNA表达水平明显高于癌旁正常组织(P<0.01，图1A)；GEO和UALCAN数据库分析显示，与癌旁正常组织相比，结肠癌组织中NCAPD2 mRNA的表达水平显著上调(P<0.01，图1B、C)。进一步分析NCAPD2 mRNA的表达水平与临床病理特征的关系，发现其与结肠癌临床分期和淋巴结转移密切相关(P<0.05)：在不同分期的结肠癌组织中NCAPD2的表达水平均显著高于癌旁正常组织(图2A)；且结肠癌无淋巴结转移(N0)和有淋巴结转移(N1～N2)组织中NCAPD2 mRNA表达水平均高于癌旁正常组织(P<0.05，图2B)。此外，GEO数据库分析显示，与结肠癌组织相比，NCAPD2 mRNA在转移性结肠癌组织中的表达水平亦显著升高(P<0.01，图2C);提示NCAPD2与结肠癌的恶性演进密切相关。

图1 NCAPD2 mRNA在结肠癌组织中的表达：TIMER(A)数据库分析各种肿瘤组织中NCAPD2 mRNA表达；GEO(B)和UALCAN(C)数据库分析不同结肠组织中NCAPD2 mRNA的表达

图2 NCAPD2 mRNA在不同结肠癌组织中的表达差异：UALCAN数据库中NCAPD2 mRNA表达水平与结肠癌临床分期(A)和淋巴结转移(B)的关系；C.GEO数据库原发及转移性结肠癌组织中NCAPD2 mRNA的表达

2.2 结肠癌组织中NCAPD2蛋白表达免疫组化结果显示，NCAPD2蛋白在结肠良性病变组织中呈阴性，在结肠癌组织中呈阳性，且主要表达于细胞质和细胞核(图3)。在结肠癌组织中，NCAPD2蛋白阳性率和强阳性率分别为89.36%(84/94)和75.53%(71/94)；在癌旁正常结肠组织中NCAPD2蛋白阳性率和强阳性率分别为34.88%(30/86)和19.77%(17/86)。在结肠癌组织中NCAPD2蛋白阳性率和强阳性率均显著高于癌旁正常结肠组织，差异有显著性(P<0.01)，提示NCAPD2蛋白在结肠癌组织中表达上调。

图3 NCAPD2蛋白在癌旁正常结肠组织中呈阴性(A)，在结肠癌组织中呈弱阳性(B)、阳性(C)、强阳性(D)，SP两步法

2.3 NCAPD2蛋白过表达与结肠癌临床病理特征的关系进一步对NCAPD2蛋白过表达与结肠癌临床病理特征的关系进行分析发现，NCAPD2蛋白表达水平与结肠癌患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度及T分期无关，与临床分期和淋巴结转移有关(P均<0.05，表1)。其中，NCAPD2蛋白在结肠癌晚期(Ⅲ+Ⅳ)组织中的强阳性率(88.9%，32/36)明显高于早期(Ⅰ+Ⅱ)组织(67.2%，39/58，P=0.004，图4A)；在有淋巴结转移的结肠癌组织中的强阳性率(88.2%，30/34)明显高于无淋巴结转移组织(68.3%，41/60，P=0.031，图4B)。

表1 结肠癌组织中NCAPD2蛋白表达与临床病理特征的关系[n(%)]

图4 NCAPD2蛋白表达与结肠癌临床病理特征的关系：

2.4 生存分析Kaplan-Meier生存分析显示，NCAPD2蛋白高表达的结肠癌患者总生存期明显低于NCAPD2蛋白低表达患者(Log-rank=5.602，P=0.018，图5A)；且NCAPD2蛋白高表达的T3+T4分期结肠癌患者总生存期亦明显低于NCAPD2蛋白低表达患者(Log-rank=7.803，P=0.005，图5B)。Cox单因素分析结果显示，NCAPD2表达、临床分期和淋巴结转移均是影响结肠癌患者生存期的风险因素(P均<0.05，图6A)。Cox多因素分析显示，NCAPD2表达与临床分期均是影响患者结肠癌生存期的独立风险因素(P<0.05，图6B)；提示NCAPD2蛋白可作为结肠癌患者不良预后的独立风险因素。

图5 NCAPD2蛋白表达与结肠癌患者预后的相关性：

图6 Cox分析影响结肠癌患者预后的因素：

3 讨论

结肠癌是全球癌症死亡的主要原因之一，早期结肠癌患者的生存率高达90%，但早期诊断存在局限性，致使结肠癌患者早期诊断率不足40%[10]。

近年随着对结肠癌分子生物学特性及发病机制的深入分析，已有生物学标志物用于结肠癌的早期诊断及预后监测，如CEA、CA19-9和CA12-5等，但在癌前病变和临床早期中的诊断敏感性和特异性低[11]。罗志飞等[12]研究结果显示，不同基因的异常表达可通过影响细胞周期的紊乱促进结肠癌的演进。朱剑军等[13]在结肠癌中的研究发现，细胞周期的紊乱可以促进肿瘤细胞的恶性增殖。因此，从分子生物学水平阐明结肠癌的分子机制，寻找潜在的分子标志物具有非常重要的临床意义。

染色体凝缩蛋白复合物是一种多蛋白复合物，其包含凝缩蛋白复合物Ⅰ和Ⅱ，前者主要定位于细胞质，后者则定位于细胞核。其中，凝缩蛋白复合物Ⅰ由SMC亚单位和非SMC亚单位组成，SMC亚单位包括SMC2和SMC4，非SMC亚单位包括NCAPH、NCAPD2、NCAPG三种亚基。有研究显示，染色体凝缩蛋白复合物Ⅰ的亚基之一的NCAPD2的缺失可缩短有丝分裂前中期染色体的长度，延长细胞分裂的前中期及后期[14-15]。此外，NCAPD2上的HEAT重复组成的一个串联排列的双螺旋结构，可在蛋白质之间的相互作用中发挥重要的调控作用[16]。同时，其作为细胞周期调控因子酪蛋白激酶2的作用靶点，与细胞退化、DNA损伤位点识别等生物学功能密切相关[16-17]。虽然科研界对于NCAPD2的生物学功能有所了解，但对于NCAPD2与人类疾病，尤其是肿瘤间的相关报道较少。近年研究结果证实，NCAPD2基因多态性参与中国汉族人帕金森的发病过程[18]；NCAPD2在神经母细胞瘤中表达上调，并预示患者的不良预后[19]。Zhang等[20]研究结果亦证实了凝缩素蛋白复合物的表达水平可促进肿瘤细胞的增殖，并且可作为肝癌患者不良预后的独立风险因素。但尚无研究明确NCAPD2表达与结肠癌之间的关系。

本实验发现，NCAPD2 mRNA表达水平在结肠癌组织中显著升高，其表达与临床分期、淋巴结转移关系密切(P<0.05)。免疫组化结果与之一致，NCAPD2蛋白在结肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.05)；提示NCAPD2与结直肠癌的发生、发展存在一定的相关性。进一步相关性分析发现，NCAPD2蛋白高表达与结肠癌临床分期(P=0.001)、淋巴结转移(P=0.047)呈显著正相关；揭示NCAPD2作为癌基因在结肠癌的恶性演进中发挥重要作用。此外，Kaplan-Meier生存曲线分析、Cox回归模型显示，NCAPD2蛋白高表达的结肠癌患者的生存期显著低于NCAPD2蛋白低表达患者，且NCAPD2蛋白表达水平是结肠癌患者独立的预后不良因素；提示NCAPD2蛋白是判断结肠癌不良预后的潜在分子标志物。

综上所述，NCAPD2在结肠癌组织中的表达存在不同程度的升高，其高表达状态可预示结肠癌较强的恶性程度、转移潜能和不良预后，对结肠癌患者的早期诊断和预后评估具有一定的临床指导意义。