胃癌中CX43表达及与mTOR/p70S6K信号通路的关系

刘莎莎，赵 杨，赵 醒，刘 欢，申兴斌

胃癌是全球范围内发病率及病死率均较高的恶性肿瘤，严重影响着人类的健康[1]。我国胃癌临床诊治特点是中晚期多见，以手术治疗为主，术后化疗+靶向治疗为辅，患者存活期短[2]。目前临床上用于治疗胃癌的靶向药物较少，迫切需要寻找新的治疗靶点。有研究发现，连接蛋白43(connexin 43, CX43)介导的细胞间隙连接(gap junction intercellular communciation, GJIC)在肿瘤中的表达水平和膜定位可影响癌细胞的增殖、侵袭及转移[3]。在恶性肿瘤中，PI3K/AKT/mTOR通路的异常活化可抑制肿瘤细胞的凋亡并促进肿瘤细胞增殖及新生血管的形成[4]。其中下游mTOR/p70S6K信号通路被异常激活后，可使磷酸化的p70S6K转录和翻译活性增强，促进细胞G1期→S期的转换，导致肿瘤细胞的无限生长及增殖。CX43是否直接或间接地通过与mTOR/p70S6K的相互作用参与调节胃癌的发生、侵袭、转移过程，目前尚未见报道。本文采用免疫组化法、Western blot法及qRT-PCR技术检测CX43、mTOR和p70S6K蛋白及mRNA在胃癌及正常胃黏膜组织中的表达，并分析其相关性，为研究胃癌的发病机制及靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 一般资料收集承德医学院附属医院存档的60例胃癌手术切除标本(患者术前均未行放疗及化疗)及相应癌旁正常胃黏膜组织(距癌灶5 cm以上)，一部分新鲜组织置于-80 ℃冰箱保存用于Western blot及qRT-PCR实验，另一部分组织制成蜡块用于免疫组化染色。

1.2 免疫组化

1.2.1主要试剂 一抗兔抗人CX43多克隆抗体及mTOR单克隆抗体均购自杭州华安生物公司，兔抗人p70S6K多克隆抗体购自武汉ABclonal公司，免疫组化试剂及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥公司。

1.2.2染色步骤 所有标本固定后，常规脱水、石蜡包埋，5 μm厚切片，脱蜡及水化，抗原修复、封闭、滴加一抗等，具体步骤严格按SP试剂盒及DAB显色说明书进行，采用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.3结果判定 CX43、mTOR及p70S6K抗体阳性着色分布于细胞质，呈棕黄色颗粒，随机选择5个高倍视野，采用Vlom双评分法进行评分：(1)按阳性细胞所占百分比评分：阳性细胞数≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，≥51%为3分。(2)按染色强度评分：未着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。将两项得分结果相加作为最终结果：0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为中等阳性()，5～6分为强阳性()。

1.3 Western blot法

1.3.1主要试剂 一抗同免疫组化抗体试剂，兔单抗β-actin购自武汉ABclonal公司，RIPA裂解液购自索莱宝公司，BCA法蛋白定量试剂盒购自杭州联科公司；Sample Buffer(5×)购自贝博公司；新快速SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自庄盟公司等。

1.3.2检测步骤 取0.1 g新鲜胃癌及正常胃黏膜组织，严格按裂解液试剂盒说明提取蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，根据目的蛋白分子量大小分别制6%分离胶+5%浓缩胶和10%分离胶+5%浓缩胶，80 V条件电泳，待样品越过两种胶体分界面，改为120 V电泳，直至所需条带跑出。200 mA低温转膜，时间视分子大小而定。一抗[β-actin(1 ∶100 000)、CX43(1 ∶6 000)、mTOR(1 ∶200)、p70S6K(1 ∶10 000)]摇匀2 h后4 ℃过夜。次日，5%脱脂奶粉摇匀封闭2 h，滴加稀释后的二抗(1 ∶10 000)摇匀，约1 h，TBST清洗10 min×3次。ECL发光液按1 ∶1配置后，滴在滤纸轻度干燥后的PVDF膜上，于暗室内进行显影，实验结果以胶片上条带的方式呈现。

1.3.3结果分析 所得图像运用Image J分析得到灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参灰度值。

1.4 qRT-PCR

1.4.1主要试剂 RNA提取试剂盒购自Foregene公司，逆转录试剂盒及扩增试剂盒均购自武汉ABclonal公司等。各指标引物序列均经GeneCopoeia公司设计。

1.4.2检测步骤 所用EP管、移液器及枪头、八连管等均经无酶处理。严格按照RNA提取试剂盒步骤提取胃癌组织及正常胃黏膜组织中的总RNA，用分光光度计测定RNA浓度(以OD260/280比值在1.8～2.1为合格)。反转录为20 μL体系(总RNA 1 pg～1 μg，5×ABScript Ⅱ RT Mix 4 μL，Nuclease-free H2O补足至20 μL)，在PCR仪上按25 ℃ 5 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，12 ℃ Hold进行反转录。扩增为20 μL体系(2× Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，引物2 μL，Nuclease-free H2O 6 μL)，在CFX96 qRT-PCR仪按照95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30～34 s，40～45个循环进行操作。

1.4.3结果 所得扩增曲线、溶解曲线及CT值，计算2-△△Ct，其中ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，数据汇总，对2-△△Ct进行统计学分析。

2 结果

2.1 胃癌及正常胃黏膜组织中CX43、mTOR及p70S6K蛋白表达

2.1.1免疫组化结果 CX43、mTOR及p70S6K阳性均定位于细胞质，胃癌组织中CX43蛋白表达明显低于正常胃黏膜组织(P<0.05，表1，图1)。胃癌组织中mTOR及p70S6K蛋白表达则明显高于正常胃黏膜组织(P<0.05，表1，图2、3)。

表1 胃癌及正常胃黏膜组织中CX43、mTOR及p70S6K蛋白表达

2.1.2Western blot结果 胃癌组织中，CX43蛋白表达量低于正常胃黏膜组织，mTOR及p70S6K蛋白表达量则高于正常胃黏膜组织(P均<0.01，图4)。

图4 胃癌及正常胃黏膜组织中CX43、mTOR和p70S6K蛋白表达：

2.1.3qRT-PCR结果 胃癌组织中CX43 mRNA表达量低于正常胃黏膜组织，mTOR及p70S6K mRNA表达量则高于正常胃黏膜组织(P均<0.01，图5)。

图5 胃癌及正常胃黏膜组织中CX43、mTOR及p70S6K mRNA的表达

2.2 胃癌组织中CX43、mTOR及p70S6K表达与临床病理特征的关系胃癌组织中CX43蛋白及mRNA随着胃癌分化程度的降低、临床分期越晚、浸润程度越深、伴淋巴结转移，其表达量降低，mTOR和p70S6K蛋白及mRNA表达则与CX43相反(P均<0.05，表2～4)。本实验结果显示，CX43、mTOR及p70S6K表达与肿瘤分化程度、TNM分期、浸润深度及淋巴结转移有关，与患者性别、年龄无关。

表2 胃癌组织中CX43、mTOR及p70S6K蛋白表达(免疫组化)与临床病理特征的关系

2.3 胃癌组织中CX43、mTOR及p70S6K表达的相关性胃癌组织中CX43与mTOR及p70S6K蛋白的表达均呈负相关(r=-0.255，P<0.05；r=-0.273，P<0.05),mTOR与p70S6K蛋白表达呈正相关(r=0.701，P<0.01)；CX43与mTOR及p70S6K mRNA的表达均呈负相关(r=-0.642，P<0.01；r=-0.678，P<0.01)，mTOR与p70S6K mRNA表达呈正相关(r=0.630，P<0.01)。

表3 胃癌组织中CX43、mTOR及p70S6K蛋白表达(Western blot)与临床病理特征的关系

表4 胃癌组织中CX43、mTOR及p70S6K mRNA表达与临床病理特征的关系

3 讨论

细胞间的通讯方式主要有间接通讯(如激素、生长因子及第二信使等)和细胞连接(包括封闭连接、锚定连接和通讯连接)。其中有关通讯连接的研究较多，GJIC是由6个相同或相似的连接蛋白(connexin, CX)环绕而成一直径约1.5 mm的亲水性跨膜孔道，孔道在相邻细胞各占一半，其通过相互滑动的方式开启或关闭，使得相对分子质量<1.0×104的小分子(如有机离子K+、Na+、Ca2+等)、第二信使(CGMP、CAMP等)及水溶性小分子量代谢物(如氨基酸、葡萄酸等)直接从一个细胞进入到相邻细胞，参与细胞正常的增殖与分化、细胞稳态的维持等过程。GJIC的功能下降或异常，可导致细胞增殖分化出现异常，促使肿瘤的形成。

目前发现的CX蛋白有21种，在胃组织中发现的类型有CX6、CX32和CX43，其中CX43与肿瘤的关系最为密切，因此其成为研究的热点。Li等[5]通过电镜观察到在胃癌组织中CX43介导的GJIC结构遭到破坏，且随着恶性程度的增加，破坏加重，由此推断CX43介导的GJIC功能缺失或下降，可能是促癌变阶段的重要机制。本实验发现，与正常胃黏膜组织相比，胃癌组织中CX43的表达明显下降，且在低分化、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、浸润全层、伴淋巴结转移的胃癌组织中CX43的表达量低于高+中分化、临床TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、浸润未达全层、无淋巴结转移的胃癌组织，表明CX43表达减少或缺如参与了胃癌的发生发展、浸润及转移。这与Tang等[6]的研究结果一致。赵宇等[7]研究发现CX43蛋白在肝细胞癌中的定位存在异常，其在正常细胞中均定位于细胞间相互接触的细胞膜，在肝细胞癌中仅有极少量定位于胞膜，CX43表达多定位于细胞质，表达程度的减弱及定位的改变最终导致细胞膜上有功能性的GJ形成下降，这可能是肝细胞癌发生的重要环节之一。目前有研究通过一些手段预防或改变CX43在细胞膜上定位的恢复，或者上调CX43在细胞膜上的表达，使GJIC功能恢复，从而预防或抑制胃癌的进展。如Liu等[8]的研究发现HP感染相关的胃癌中GATA-3可直接与启动子结合而抑制CX43的产生，使GATA-3沉默则可上调CX43的表达，从而抑制胃癌的进展。张立伟等[9]的研究发现，在胃癌中抑制磷酸化的细胞骨架蛋白(p-Ezrin)能够减少CX43的磷酸化，恢复GJIC功能，从而抑制肿瘤发生。本实验发现，在胃癌及正常胃黏膜组织中CX43阳性产物均位于细胞质内，可能与抗体的选择有关，在胃癌中是否也存在CX43定位的异常仍需进一步探究。

mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶蛋白质家族成员。p70S6K属于mTOR下游底物之一。激活的mTOR能促进p70S6K的磷酸化，磷酸化的p70S6K可以提高5′-TOR mRNA的翻译效率，同时使p70S6K活性明显增加，从而显著增加蛋白质的合成，参与细胞的生长及增殖，过度激活mTOR/p70S6K信号通路，能够促进癌细胞的增殖、血管形成、抑制细胞凋亡及自噬[10]。Liu等[11]和唐男等[12]研究发现，在胆囊癌、卵巢上皮性癌中mTOR和p70S6K异常激活，且两者表达呈正相关，均与肿瘤分化程度、TNM分期、有无淋巴结转移等相关，与患者年龄、性别等无关。本实验结果显示，在胃癌组织中mTOR及p70S6K在基因及蛋白水平均存在过表达，并且随着肿瘤恶性程度的增加、TNM分期越晚、浸润程度加深、伴淋巴结转移，胃癌组织中mTOR及p70S6K的表达量更多，其中p70S6K的表达量增加的尤为明显，说明在mTOR过度激活后刺激更多的p70S6K活化，导致胃癌细胞的过度增殖。综上可见，mTOR在肿瘤组织中高表达，提示mTOR/p70S6K信号通路的特异性激活可能参与了肿瘤的发生、浸润及转移过程。mTOR/p70S6K信号通路在多种肿瘤中被异常激活，因此其处于该信号通路的核心地位，同时也是治疗肿瘤的潜在靶点。研究表明，雷帕霉素及其衍生物可以有效阻断多种恶性肿瘤中mTOR和p70S6K的磷酸化，从而抑制肿瘤的生长。但从临床试验结果进行分析显示[13-14]，在胃癌的抗mTOR单药靶向药物治疗中，晚期胃癌患者的中位生存期及肿瘤控制率未显示出该药物的有效性。可能是因为雷帕霉素及其类似物通过负反馈引起Akt过度活化，减弱了其抗肿瘤作用，限制了单药靶向治疗的作用[15]。因此需要研究多点靶向联合抑制剂，从而达到抑制胃癌细胞生长的作用。

Chen等[16]的研究结果表明，糖皮质激素通过抑制Akt/mTOR信号通路抑制骨组织中CX43的表达，是糖皮质激素引起骨质疏松的发病机制之一。Bi等[17]的研究发现在模拟糖尿病患者急性低血糖即高糖后低糖过程中，通过激活PI3K/Akt/mTOR和MEK/ERK1/2信号通路可下调H9c2心肌细胞CX43的表达。在胃癌中CX43是否直接或间接地通过与PI3K/Akt/mTOR信号通路的相互作用参与调节胃癌的发生发展、侵袭及转移过程，目前未见相关报道。本实验结果显示，CX43表达降低和mTOR/p70S6K信号通路的激活均与胃癌的发生发展、侵袭及转移有关。采用Pearson相关性分析结果显示，胃癌组织中CX43与mTOR、p70S6K蛋白及mRNA表达均呈负相关。作者推测在胃癌中CX43表达下降，除了导致GJIC功能抑制或缺陷外，可能还通过与mTOR/p70S6K信号通路的相互作用参与调节胃癌的发生、侵袭及转移过程，但具体作用机制仍有待进一步探究。这一发现为研究胃癌发病机制及靶向治疗提供了研究方向。