半枝莲提取物通过PI3K-Akt信号通路抑制胰腺癌模型大鼠肿瘤生长的机制研究

袁文婷,肖茂良,肖 锋

(湖南中医药高等专科学校附属第一医院 湖南省直中医医院，湖南 株洲412000)

胰腺癌主要临床表现为乏力、黄疸、食欲不振、腹部疼痛，具有早期诊断率低、恶性程度高、治疗难度大、病死率高、预后差的特点，对患者身体健康及生命造成严重威胁[1-4]。据相关流行病学调查显示，近年来我国胰腺癌症状发病率呈现上升趋势[5-6]。有研究表明，胰腺癌治疗难度较大，西医治疗胰腺癌的疗效并不理想，因此越来越多的专家学者致力于中医药治疗胰腺癌的研究[7]。有研究证实，中药提取物干预胰腺癌细胞能够抑制其增殖，促进胰腺癌细胞凋亡，但是关于中药提取物干预胰腺癌动物模型的研究鲜有报道[8-9]。本文采用半枝莲提取物干预胰腺癌模型大鼠，观察其对胰腺癌细胞、T淋巴细胞亚群、Wnt/β-catenin通路及PI3K-Akt信号通路蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SD健康雄性大鼠40只，由吉林大学动物实验中心提供，年龄8～10个月，平均(9.0±0.8)个月；体重220～234 g，平均(226.9±4.7)g。在相对湿度50%～55%、温度(24.1±2.1)℃的环境中喂养大鼠1周，光照12 h/d。

1.1.2 主要试剂：半枝莲(亳州市亿弘堂药业有限公司)；小鼠抗大鼠Wnt3α抗体(批号H20181002，Hyclone公司)；兔抗大鼠β-catenin抗体(批号H20180901，Selleck公司)；小鼠抗兔PI3K抗体(批号H20181101,Dako公司)；兔抗小鼠Akt抗体(批号H20180801，BD公司)；大鼠抗小鼠mTOR抗体(批号H20181001，Gibco公司)；CD8+、CD4+、CD3+单克隆抗体(批号H20180302、H20180401、H20181001)；PBS(批号H20181102)；蛋白酶K(批号H20181001)；平衡缓冲液(批号H20181201)；SSC溶液(批号H20180701)；TdT酶反应液(批号H20180802)；聚丙烯酰胺凝胶(批号H20181202)。

1.2 实验方法

1.2.1 半枝莲提取物制备：半枝莲50 g粉碎得到半枝莲粉，按照1∶20比例添加70%乙醇静置24 h，70 ℃水浴处理4次，2 h/次，过滤，取滤液，按照1∶20比例向药渣内添加蒸馏水，加热2 h，取滤液，合并2次所得滤液，按照1 g半枝莲提取液=5.14 g半枝莲生药换算，添加0.9%的氯化钠溶液配制不同浓度半枝莲提取物溶液。

1.2.2 建模、分组与给药：随机选取10只大鼠为正常组，不做任何处理。其余30只大鼠建立胰腺癌模型，方法如下：对大鼠进行麻醉后固定，于腹部正中做10 mm小切口，显露出胰腺组织，将胰腺被膜及胰腺实质切开1 mm，植入9 mg DMBA(批号H20180901)后缝合切口，消毒。30 d后大鼠皮下出现1 cm左右结节为胰腺癌建模成功。30只大鼠共建模成功24只，随机分为模型组、低浓度半枝莲组、高浓度半枝莲组各8只。正常组、模型组大鼠予0.9%的氯化钠溶液灌胃处理，低浓度半枝莲组、高浓度半枝莲组大鼠分别使用20、60 mg/kg半枝莲提取物溶液灌胃处理，每组均连续干预14 d，1次/d。

1.2.3 标本的采集与处理：所有大鼠干预结束后，取尾部静脉血2 ml，2000 r/min离心处理15 min后分离上清液，在-80 ℃环境中保存待检。采用断头法处死大鼠，分离胰腺组织，测量胰腺肿瘤组织体积、重量后将其固定于4%甲醛溶液24 h。

1.2.4 组织病理学检测：将标本于甲醛溶液内固定后予常规石蜡包埋并切片，切片烤干后脱蜡，顺序置入不同浓度梯度酒精中各复水3 min，苏木精染色15 min后清洗3次，盐酸酒精分化处理30 s，充分清洗后予1%伊红染色，酒精脱水，脱蜡，封片后显微镜下观察。

1.2.5 T淋巴细胞亚群检测：待测标本予抗凝处理后分为两管，分别加入20 μl的CD8+、CD4+、CD3+单克隆抗体，室温环境下孵育30 min后在各管内加入融血剂，待其完全溶血后离心，3000 r/min，离心5 min，弃上清液，洗涤液洗涤后在各管内加入150 μl固定剂，加入0.5 ml的PBS混合均匀制备为悬液，采用流式细胞仪检测CD8+、CD4+、CD3+水平。

1.2.6 TUNEL法检测细胞凋亡：细胞常温下予20 μg/ml蛋白酶K培养0.5 h后去除蛋白，清洗后加入100 μl平衡缓冲液，室内平衡10 min，滴入100 μl的TdT酶反应液，避光、室温孵育1 h后加入100 μl的SSC溶液，静置20 min后清洗3次，DAPI复染，避光培养10 min后清洗、封片观察。DAPI复染细胞核呈蓝色，凋亡细胞细胞核呈绿色，取每切片3个视野进行观察，计算细胞凋亡率。

1.2.7 蛋白印迹法检测Wnt3α、β-catenin、PI3K、Akt、mTOR相对表达量：取Ripa裂解液，PMSF冰中孵育30 min，1500 r/min，离心15 min，取上清。每个样品取15 g蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转入PDVF膜，5%脱脂牛奶常温密封2 h，加入抗体过夜孵育，TBST液冲洗，加入二抗，60 min后清洗、显色，计算Wnt3α、β-catenin、PI3K、Akt、mTOR相对表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠胰腺组织形态学比较 正常组大鼠胰腺组织细胞排列整齐，大小一致，界限清晰，细胞核均匀；模型组大鼠胰腺组织细胞细胞排列较为杂乱，且伴有严重炎症细胞浸润现象；高浓度半枝莲组大鼠胰腺组织细胞排列较为整齐，大小相对一致，炎症细胞浸润现象明显缓解(图1)。

图1 各组大鼠胰腺组织形态图(HE染色，×400)

2.2 各组大鼠肿瘤组织体积、重量比较 见表1。与模型组比较，低浓度半枝莲组、高浓度半枝莲组大鼠肿瘤组织体积小、重量均轻，差异有统计学意义(P<0.05)。与低浓度半枝莲组比较，高浓度半枝莲组大鼠肿瘤组织体积小、重量均轻，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠肿瘤组织体积、重量比较

2.3 各组大鼠CD8+、CD4+、CD3+水平比较 见表2。与正常组大鼠比较，模型组、低浓度半枝莲组、高浓度半枝莲组大鼠CD8+水平较高，CD4+、CD3+水平较均低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，低浓度半枝莲组、高浓度半枝莲组大鼠CD8+水平较低，CD4+、CD3+水平均较高，且高浓度半枝莲组大鼠CD8+水平低于低浓度半枝莲组，CD4+、CD3+水平均高于低浓度半枝莲组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠CD8+、CD4+、CD3+水平比较(%)

2.4 各组大鼠肿瘤组织细胞凋亡率比较 低浓度半枝莲组、高浓度半枝莲组大鼠细胞凋亡率分别为(16.59±2.13)%、(25.71±2.96)%，均高于模型组(2.98±0.39)%的细胞凋亡率，差异有统计学意义(P<0.05)；且高浓度半枝莲组大鼠细胞凋亡率高于低浓度半枝莲组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 各组大鼠Wnt3α、β-catenin相对表达量比较 见表3。与正常组大鼠比较，模型组、低浓度半枝莲组、高浓度半枝莲组大鼠Wnt3α、β-catenin相对表达量均较高，且低浓度半枝莲组、高浓度半枝莲组大鼠Wnt3α、β-catenin相对表达量均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；与低浓度半枝莲组比较，高浓度半枝莲组大鼠Wnt3α、β-catenin相对表达量均较低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组大鼠Wnt3α、β-catenin相对表达量比较

2.6 各组大鼠PI3K、Akt、mTOR相对表达量比较 见表4。与正常组比较，模型组、低浓度半枝莲组、高浓度半枝莲组大鼠PI3K、Akt、mTOR相对表达量均较高，差异有统计学意义(P<0.05)；且低浓度半枝莲组、高浓度半枝莲组大鼠PI3K、Akt、mTOR相对表达量均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；与低浓度半枝莲组比较，高浓度半枝莲组大鼠PI3K、Akt、mTOR相对表达量均较低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组大鼠PI3K、Akt、mTOR相对表达量比较

3 讨 论

胰腺癌作为临床上恶性程度极高的肿瘤，5年生存率低于5%，其发病原因及发病机制尚未阐明[10-11]。西医抗肿瘤药物具有较多的不良反应，中医药治疗恶性肿瘤则具有细胞毒性小的优势[12]。半枝莲有悠久的药用历史，具有化瘀、解毒、清热、调节免疫等功效。有研究表示，半枝莲能够诱导细胞凋亡、自噬，抑制细胞增殖、转移，具有一定的抗肿瘤作用[13-14]。本研究显示，半枝莲提取物干预的胰腺癌大鼠肿瘤组织体积减小、重量减轻，且随半枝莲提取物浓度升高，肿瘤组织体积、重量下降幅度越大，说明半枝莲提取对胰腺癌组织的生长具有一定的抑制作用，且呈浓度依赖性，其原因可能是半枝莲提取物能够有效促进胰腺癌大鼠癌细胞凋亡，抑制癌组织的生长。胰腺癌的发生发展与细胞增殖、凋亡关系密切，其可促进胰腺癌细胞凋亡，抑制胰腺癌细胞增殖，抑制进一步扩散[15-17]。本研究对胰腺癌大鼠癌细胞凋亡检测结果显示，半枝莲提取物干预胰腺癌模型后，胰腺癌细胞凋亡率明显上升。说明半枝莲提取物具有促进胰腺癌组织细胞凋亡的作用，且呈浓度依赖性。

胰腺癌的发生发展与机体免疫功能水平密切相关，调节胰腺癌患者免疫功能是治疗及改善其预后的关键[18]。T淋巴细胞亚群是评价机体细胞免疫功能的指标，本文研究结果显示，与正常大鼠比较，胰腺癌模型大鼠T淋巴细胞亚群CD8+、CD4+、CD3+水平明显异常，半枝莲提取物干预的胰腺癌大鼠CD8+、CD4+、CD3+水平明显改善，且随半枝莲提取物浓度升高，CD8+、CD4+、CD3+水平改善更明显，说明胰腺癌可导致机体免疫功能异常，半枝莲提取物具有调节免疫的作用，且呈浓度依赖性。

Wnt/β-catenin通路参与癌细胞分化、自噬等生物学行为，Wnt3α、β-catenin是Wnt/β-catenin通路的主要配体，二者表达的变化与细胞自噬、凋亡密切相关[19-20]。本研究结果显示，胰腺癌模型大鼠癌组织Wnt3α、β-catenin表达异常升高，半枝莲提取干预后胰腺癌大鼠癌组织Wnt3α、β-catenin表达明显下调，随半枝莲提取物浓度升高，Wnt3α、β-catenin表达下调更显著，说明半枝莲提取物干预胰腺癌模型大鼠，能够通过Wnt/β-catenin通路调控胰腺癌细胞分化、自噬能力，从而抑制胰腺癌进展。PI3K-Akt信号通路相关蛋白P13K、Akt、mTOR表达变化与细胞凋亡能力密切相关，参与胰腺癌的发病[21-22]。本研究结果显示，胰腺癌模型大鼠癌组织P13K、Akt、mTOR异常高表达，半枝莲提取物干预的胰腺癌大鼠癌组织P13K、Akt、mTOR蛋白表达明显下调，随半枝莲提取物浓度的升高，P13K、Akt、mTOR表达下调更显著，说明半枝莲提取物干预胰腺癌模型大鼠通过调控PI3K-Akt信号通路，促进胰腺癌细胞凋亡，抑制胰腺癌进展。

综上所述，半枝莲提取物可抑制胰腺癌模型大鼠肿瘤组织，调控胰腺癌大鼠T淋巴细胞亚群水平，调控Wnt/β-catenin通路及PI3K-Akt信号通路相关蛋白表达，促进胰腺癌细胞自噬、凋亡。