凤香洗液中“丁香-苦参”配伍干预子宫内膜癌的活性成分及作用机制预测分析

陆小宇,罗 慧,何 鸳,胡鑫洁,周 瑞,朱虹丽,李 楠,陈 梅

(1.陕西中医药大学第一临床医学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳712021；3.陕西中医药大学 陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心，陕西 咸阳 712083)

子宫内膜癌(Endometrial carcinoma，EC)是原发于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，以来源于子宫内膜腺体的腺癌最常见[1]。EC没有明确的中医病名，因其主要症状为阴道异常出血、排液、经期延长等，且大多数患者在绝经后发病，因此本病属中医“崩漏”“五色带”“经断复来”等范畴[2-3]。凤香洗液是陕西省名中医贺丰杰教授研发的中药复方制剂，主要由丁香、苦参、地龙、蛇床子等7味中药组成，在临床上被广泛用于治疗阴道炎和宫颈病变，疗效较好，且已有临床实验研究证明其对于人乳头瘤病毒感染导致的宫颈上皮内瘤变有抑制作用[4]，基于此本研究探讨凤香洗液对EC的干预机制。网络药理学是研究中药的前沿学科，主要运用网络学方法分析药物与疾病、靶点之间“多成分、多靶点、多途径”协同作用关系，探讨药物与疾病之间的关系与变化规律，从而阐明中药活性成分及作用机制，预测中药作用靶点，为中药及复方制剂的进一步研究提供依据[5-6]。因此，本研究选用方中丁香-苦参两味中药，通过网络药理学方法分析预测凤香洗液干预EC的作用机制。

1 资料与方法

1.1 研究资料 本研究涉及的数据来源及分析平台主要有中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)数据库、Gene Cards 数据库、Uniprot 数据库、OMIM 数据库、Cytoscape 3.7.2 软件、Venny 2.1在线平台、String数据库、DAVID 数据库。

1.2 研究方法

1.2.1 丁香-苦参活性成分、靶点收集及网络构建：以丁香、苦参为关键词通过TCMSP数据库搜索活性成分，筛选条件为类药性(Drug like，DL)≥0.18，-2≤脂水分配系数(AlogP)≤4；最终筛选出符合条件的候选活性成分，然后将收集到的靶点在 Uniprot 数据库中进行规范。利用 Cytoscape 3.7.2 软件分析活性成分-靶点关联信息，构建出丁香-苦参活性成分-靶点网络图，并分析候选活性成分和靶点间的度值(Degree)。

1.2.2 EC相关靶点收集：以“endometrial cancer”为关键词在Gene Cards 数据库和OMIM 数据库中收集EC相关靶点。在 Gene Cards 数据库中，靶点与疾病之间的相关性与Score值大小成正相关，值越高则代表该靶点与疾病相关性越大，设定Score值大于中位数的目标靶点为潜在疾病靶点[7]，将两个数据库收集到的靶点合并删除重复靶点，最终得到疾病相关靶点。

1.2.3 活性成分-疾病靶点蛋白互作(PPI)网络构建：将药物活性成分靶点与疾病靶点取交集，使用Venny 2.1在线平台绘制韦恩图。将交集靶点导入String数据库，选择“Homo sapiens”物种，将“highest confidence”>0.9设定为最小互相作用阈值，构建共同靶点PPI网络，然后导入Cytoscape 3.7.2 软件，可视化处理得到 PPI网络图。

1.2.4 GO功能注释和KEGG通路富集分析：将丁香-苦参活性成分、疾病共同靶点导入DAVID 数据库，将Select identifier设定为“Official gene symbol”，限定物种为“Homo sapiens”，List type设定为Gene list，进行GO功能分析和 KEGG 通路富集分析。

1.2.5 活性成分-靶点-信号通路网络构建：运用 Cytoscape 3.7.2 软件构建成分-靶点-信号通路网络图，分析活性成分及靶点的网络拓扑参数，并根据网络拓扑学参数判断核心靶点及发挥药效的主要活性成分。

2 结 果

2.1 丁香-苦参活性成分及靶点的获取 利用 TCMSP 数据库筛选得到31个活性成分，其中丁香活性成分6个，苦参活性成分25个，见表1。获得225个丁香活性成分相应靶点，465个苦参活性成分相应靶点，运用 Cytoscape 3.7.2构建活性成分-靶点网络图，图中深紫色六边形代表活性成分；浅紫色菱形代表靶点(图1)。

表1 丁香-苦参主要活性成分

2.2 EC相关靶点的获取 从 Gene Cards 数据库获得EC相关靶点3249个，筛选后得到2754个；检索OMIM数据库后补充500个EC相关靶点，合并后删除重复靶点，最终得到1627个EC相关靶点(图1)。

2.3 活性成分-疾病靶点 PPI网络的构建 通过 TCMSP 数据库共收集31个活性成分，筛选去重后得到203个活性成分靶点，通过韦恩图将筛选的丁香-苦参活性成分靶点与EC靶点取交集，得到活性成分-疾病共同靶点146个。将共同靶点提交至String数据库，获取相互作用关系的网络，将TSV 文本导入Cytoscape 3.7.2 软件进行网络拓扑学分析。结果显示PPI网络共包含138个节点，656条边，根据Degree值>15筛选出27个重要靶点，分别是：AKT1、TP53、TNF、JUN、MAPK1、RELA、IL6、MAPK14、ESR1、MAPK8、VEGFA、FOS、RB1、CCND1、EGFR、NR3C1、RXRA、CASP8、INS、NCOA1、IL1B、CXCL8、MYC、CDKN1A、CASP3、IL4、STAT1，提示以上靶点在丁香-苦参干预EC过程具有重要意义(图2)。

图2 丁香-苦参干预EC核心靶点PPI网络

2.4 GO功能注释和KEGG通路富集分析 将从上述研究中筛选得到的核心靶基因导入DAVID数据库中进行GO功能注释和KEGG通路富集的分析。GO功能注释共导出生物过程595个，以P<0.01且Count值≥20为条件进行筛选，得到GO生物过程12个，见表2。说明丁香-苦参可能通过RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、凋亡过程的负调控等生物过程发挥干预EC的作用。

表2 丁香-苦参活性成分与EC共同靶点GO功能注释分析表

进一步进行KEGG分析，KEGG的分析共导出通路115条，再按照P<0.01且Count值≥25的条件选择通路，得到KEGG通路8条，见表3。GO功能注释和KEGG通路富集分析结果来看，丁香-苦参可能通过癌症通路、PI3K-Akt信号通路等来发挥干预EC的治疗作用。

表3 丁香-苦参活性成分与EC共同靶点KEGG富集分析

2.5 活性成分-靶点-信号通路网络构建 通过 Cytoscape 3.7.2软件构建活性成分-靶点-信号通路网络，网络共包含 197个节点，1032条边，绿色的六边形节点代表药物的活性成分，深绿色菱形节点代表核心靶点，蓝色倒三角节点代表通路；节点的面积代表其度数，节点的重要程度与面积成正相关(图3)。通过 Cytoscape 3.7.2 内置的Network Analyzer 分析网络拓扑学参数，得到核心成分及核心作用靶点。槲皮素连接度为107，介度为0.2451，紧密度为0.6049，预测槲皮素为丁香-苦参干预EC的最主要成分，见表4。前列腺素G/H合酶 2(PTGS2)在网络中的连接度为30，介度为0.0818，紧密度为0.5065，预测PTGS2为丁香-苦参干预EC的最主要靶点；癌症通路连接度为54，介度为0.057，紧密度为0.456，预测癌症通路为丁香-苦参干预EC的最主要通路。

图3 丁香-苦参活性成分-靶点-信号通路网络图

表4 丁香-苦参主要成分网络节点特征参数

3 讨 论

EC在我国女性恶性肿瘤中发病率仅次于宫颈癌，且发病年龄逐渐年轻化，严重危害女性生命健康[8]。目前，EC早期多釆用手术联合化疗，晚期或无法手术的患者主要釆取放、化疗及激素为主的治疗方法，不良反应较多，中医药在治疗本病方面具有一定优势[9]。中药具有多成分、多靶点、多通路的协同调控作用，作用机制复杂多样，对于多种疾病的防治具有自身的特色和优势[10-11]。凤香洗液经过长期临床实践和实验观察，具有抗肿瘤、抗病毒及杀虫作用，同时在调节局部免疫方面发挥着重要作用[12]。丁香性温，味辛，归脾胃、肾经。现代药理研究表明，丁香属植物具有抑制病毒生长、抗菌消炎、抗氧化等作用[13]。丁香所含酚苷类化合物紫丁香苷可以诱导肿瘤细胞的凋亡信号通路，其抗氧化活性能有效减少和对抗自由基的伤害，从而发挥抗肿瘤的功效[14]。苦参性寒，味苦，归心、肝、胃、大肠和膀胱经。现代药理学研究发现苦参能增加网状内皮细胞的吞噬作用，具有杀虫止痒、抗菌、抗病毒及抗肿瘤等功效[15]。另外，苦参可通过阻滞肿瘤细胞周期、诱导细胞凋亡和改善肿瘤炎症微环境等多种途径发挥抗癌作用[16]。

本研究基于网络药理学研究方法，分析凤香洗液中丁香和苦参两味中药干预EC的有效成分、潜在靶点、作用通路及潜在分子机制，为凤香洗液治疗EC提供理论依据。活性成分-靶点-信号通路网络图显示，槲皮素、芹菜素、木犀草素、山奈酚和芒柄花黄素5种活性成分关联度较高，说明这5种成分可能是丁香-苦参干预EC的关键活性成分。丁香-苦参两味中药排名第一的活性成分均是槲皮素，槲皮素是广泛存在于植物中的黄酮类化合物，其对多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用，可诱导肿瘤细胞凋亡，阻滞细胞周期，调控细胞信号通路，通过抑制肿瘤细胞内多种耐药相关蛋白的活性及表达，起到逆转肿瘤细胞耐药性的作用[17-20]。芹菜素属于天然的黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多种生物学作用[21]。芹菜素可通过PI3K/Akt信号通路激活凋亡蛋白Caspase-3，诱导细胞凋亡，同时下调周期蛋白Cyclin D1、D3和Cdk4阻滞细胞周期，抑制Hela细胞的增殖。芒柄花黄素及其衍生物因具有雌激素活性而发挥有效的抗癌作用。采用芒柄花黄素干预EC细胞HEC-1A荷瘤裸鼠，其通过下调内源性FOXA1、GATA-3蛋白表达维持体内的内分泌平衡从而抑制EC[22]。

活性成分-靶点-信号通路的网络拓扑属性分析结果显示，丁香-苦参干预EC的靶点主要包括前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、AKT1、前列腺素G/H合酶1(PTGS1)、转录因子p65(RELA)、丝氨酸蛋白酶(PRSS1)及丝裂原活化蛋白激酶家族成员(MAPK1)等。PTGS2是生成前列腺素的关键酶，PTGS2基因的扩增与过表达与炎症、心血管疾病、某些上皮肿瘤、消化系统良性癌前病变和恶性肿瘤关系密切[23-25]。同时PTGS2基因是包括宫颈癌、乳腺癌、结肠癌等肿瘤疾病易感性和预后的生物标志物[26]。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，参与包括细胞增殖与代谢、周期与转录调控等多种生物学过程，并参与炎症、肿瘤、糖尿病及心血管疾病的发生发展[27]。AKT1在肿瘤细胞的存活与增殖过程中的作用举足轻重，缺乏AKT1可导致乳腺上皮肿瘤细胞的增殖能力降低，抑制AKT1的表达可诱导肝癌细胞自噬死亡[28-30]。

GO功能注释和KEGG信号通路富集分析发现丁香-苦参活性成分主要体现在RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、凋亡过程负调控、信号转导、细胞增殖的正调控、凋亡过程等生物过程。KEGG通路富集分析显示主要涉及癌症信号、PI3K/Akt、乙肝、癌症蛋白聚糖信号通路等，其中癌症通路的靶点富集数目最多。PI3K/Akt作为细胞内重要的信号转导通路之一，介导多种细胞和分子功能，包括细胞的存活、增殖与代谢，多种类型癌症中均存在此通路的表达失调，其可促进肿瘤的进展和耐药。PI3K/Akt信号通路在EC的发生发展中起着重要作用，紫草素通过抑制PI3K/Akt信号通路中Akt的磷酸化，上调Akt下游靶蛋白Bax或下调Bcl-2诱导EC Ishikawa细胞凋亡，发挥抗EC作用[31]。

综上所述，本研究运用网络药理学方法分析得出凤香洗液中丁香-苦参干预EC的主要活性成分可能是槲皮素、芹菜素、木犀草素、山奈酚及芒柄花黄素等，并可能通过作用于PTGS2、AKT1、PTGS1、RELA、PRSS1、MAPK1等靶点，调控癌症、PI3K/Akt及癌症蛋白聚糖等信号通路抑制肿瘤细胞增殖、阻碍其侵袭与转移以及逆转肿瘤的耐药性等，从而达到干预EC的目的，体现了凤香洗液多成分-多靶点-多途径干预EC的特点。本研究结果初步验证凤香洗液中丁香-苦参配伍干预EC的作用机制，为后期的实验研究方向提供了思路与参考。凤香洗液由7种中药组成，本文仅对方中丁香-苦参干预EC的主要活性成分及机制进行预测分析，未考虑药物各成分、化合物之间的相互作用，药物体内代谢过程及给药途径的选择等因素对结果的影响，因此具有一定的局限性，需要进一步通过药理和临床实验验证。