响应面法优化牡丹籽壳黄酮提取及抑菌活性

吴永玲，王静怡，李俊伟，郭敏霞

(1. 商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000；2. 陕西秦岭特色生物资源产业技术研究院，陕西 商洛 726000)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是芍药科芍药属植物，牡丹籽产量高，且含油率高，较多的应用于牡丹籽油的榨取[1, 2]。牡丹籽壳性微寒、味苦、辛，是常用药材的一种，它富含大量的黄酮类物质，具有较好的消炎、抑菌、止痛等的作用[3～5]。近年来，随着市场上牡丹籽油需求量的日益增加，牡丹籽壳大量废弃，造成严重的资源浪费及环境问题[6, 7]，如果能进一步开发利用牡丹籽壳中的黄酮类物质，这对牡丹产业链的发展将具有非常重要的经济和现实意义[8]。

近年来，黄酮类化合物在牡丹中的提取方法多为超声辅助提取[9, 10]、膜分离提取等[11]，响应面法优化提取其总黄酮以及抑菌活性的研究较少。综合考虑经济成本及提取率的影响，研究采取传统的乙醇回流提取法，结合提取单因素分析及响应面实验优化，以期开发出提取率高、经济成本低的牡丹籽壳总黄酮提取工艺，同时对提取物进行农用抑菌活性研究，为牡丹籽壳的深层次开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂 材料：牡丹籽壳，市售，试验前烘干后粉碎，装袋备用。

主要试剂：乙醇为分析纯，芦丁标准品、NaOH等试剂为分析纯(上海阿拉丁试剂公司)。

供试菌种：甘蓝黑斑病菌(Alternariabrassicae)、苹果炭疽病菌(ColletotrichumgloeosprioidesPenz)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、苹果腐烂病菌(Cytosporasp.)等病菌均来源于西北农林科技大学无公害农药研究中心。

1.1.2 主要仪器与设备 粉碎机(BJ-300型，广州旭朗)、电子天平(S-114型，上海精科实业)、SHB-IIIA循环水式真空泵、RE-52AA旋转蒸发仪、UV-765B紫外可见分光光度计、电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9123A型，日本Shimadzu)、数控超声波清洗器(KQ5200DE型，昆山市超声仪器)、YXQ-LS-18SI型高压灭菌锅、生化培养箱(LRH-70F，上海齐欣)。

1.2 方法

1.2.1 牡丹籽壳总黄酮的提取 牡丹籽壳烘干粉碎后，称取10 g用95%的乙醇浸泡，采用超声辅助溶剂提取法得到提取液，过滤得到上清液，即为牡丹籽壳提取液。

1.2.2 标准曲线的绘制 参照文献[12]中的方法，配制得到系列芦丁对照品溶液并制作标准曲线方程。

1.2.3 总黄酮得率的测定 测定牡丹籽壳总黄酮类物质的含量采用硝酸铝显色法，在510 nm处的吸光度利用紫外可见分光光度计进行测定，牡丹籽壳总黄酮由回归方程求出浓度。

1.2.4 单因素试验 如表1所示，称取10 g的牡丹籽壳，采取单因素法，考虑乙醇浓度、超声功率、提取时间和提取温度四个因素，研究牡丹籽壳总黄酮得率。

表1 考察因素及变量

1.2.5 响应面优化试验 综合单因素试验结果，如表2，采用Box-Behnken设计试验，参考牡丹籽壳总黄酮得率，选择具有明显得率的因素作为优化牡丹籽壳黄酮提取工艺条件，采用Design-Expert.V8.0.6.1软件分析数据。

表2 Box-Behnken设计因素及水平

1.2.6 抑菌活性测定试验 牡丹籽壳总黄酮提取液对七种植物病原菌的抑制率和EC50值采用生长速率法测得[13～15]。配制100 μg·mL-1浓度的将牡丹籽壳总黄酮母液，取1 mL加入100 mL的PDA培养基中混合均匀即制成含药培养基(100 mg·L-1)，然后分别将菌饼接种到含药培养基上，每个浓度重复3次，设置空白对照，置于培养箱中培养(26 ℃，72 h)，测得供试菌的生长直径，得到抑菌率(公式1)。根据抑制率的结果选择合适的浓度进行倍半稀释，配制系列浓度含药溶液，再采用生长速率法对七种病原菌进行抑制率测定，求出毒力回归方程，并计算EC50值。

(1)

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制备

所得标准曲线方程为：y=1.0268x+0.0056。因R2=0.9977接近于1，表明芦丁浓度与吸光度两者之间线性关系良好。所得曲线图如图1所示。

图1 芦丁标准曲线

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇浓度对牡丹籽壳中黄酮类物质提取率的影响 如图2a可知，总黄酮得率在乙醇浓度为50%～60%时增加较快，最大值为1.410%。当乙醇浓度大于60%时，总黄酮类物质的得率开始逐渐下降，这与脂溶性物质溶解量有关。因此，可确定60%为超声提取牡丹籽壳总黄酮的最佳乙醇浓度。

2.2.2 超声功率对牡丹籽壳中黄酮类物质提取率的影响 如图2b可知，超声波功率在100～120 W之间时，牡丹籽壳总黄酮得率显著增加，当超声功率为120 W时黄酮得率最大为1.431%。超声功率进一步大于120 W时，总黄酮得率下降，这可能是大分子杂质也加速溶出，从而影响了黄酮得率。故牡丹籽壳总黄酮提取的最佳超声功率为120 W。

2.2.3 提取温度对牡丹籽壳中黄酮类物质提取率的影响 如图2c可知，提取温度在40～50 ℃之间时，牡丹籽壳总黄酮的得率逐渐增大，且黄酮得率最大值为1.389%(50 ℃)。当温度高于50 ℃时开始下降，这与牡丹籽壳中黄酮类物质的结构随温度升高而破坏有关，故牡丹籽壳总黄酮最佳提取温度应为50 ℃。

2.2.4 提取时间对牡丹籽壳中黄酮类物质提取率的影响 如图2d可知，黄酮得率最大为1.369%，在30～40 min之间时黄酮提取率呈增大趋势。40 min之后黄酮得率逐渐下降，这可能是因为超声时间越长，牡丹籽壳和乙醇溶液接触越充分以致总黄酮类化合物溶出较多，已溶出的黄酮类物质可能会随其他大分子溶出或降解，故牡丹籽壳总黄酮类物质的最佳提取时间为40 min。

图2 单因素实验中各因素对牡丹籽壳黄酮得率的影响

2.3 响应面优化实验

2.3.1 回归模型的建立及方差分析 综合单因素实验结果，选择Design-ExpertV8.0.6.1执行Box-Behnken中心组合设计模型，固定提取时间为40 min，以牡丹籽壳黄酮得率(Y)与乙醇浓度(A)、超声功率(B)、提取温度(C之间)建立回归模型，对表3,续表3中响应面试验结果进行多次回归拟合，得到回归方程：Y=1.39+0.057A+0.040B+0.038C-0.023AB+0.044AC-8.000E-003BC-0.19A2-0.067B2-0.083C2

表3 牡丹籽壳黄酮提取率响应面实验设计

续表3 牡丹籽壳黄酮提取率响应面实验设计

2.3.2 响应面交互作用分析 如表4所示，模型达到极显著水平(回归模型P<0.0001)，同时方程失拟项P=0.8176，证明模型选择可靠、预测值与实际值相差不大，故可用此模型分析和预测影响牡丹籽壳中黄酮提取率的三个因素变化规律。此外，由P值可得，牡丹籽壳黄酮提取率的影响因素为A(乙醇浓度)>B(超声功率)>C(提取温度)。这三者对牡丹籽壳黄酮提取率的影响都极显著，进一步表明这三个因素均与牡丹籽壳黄酮提取率直接相关。

表4 回归模型的方差分析

将模型中A、B和C三因素在方差分析的基础上固定在中间水平上，牡丹籽壳黄酮的得率作为响应指标[16]，得出其他两个因素交互作用牡丹籽壳黄酮提取模型，并根据该模型绘制等高线图与3D图。如图3所示，等高线弯曲程度则反应了两因素之间的交互作用大小[17, 18]，可知乙醇浓度与提取温度交互作用对提取率的影响较大，而其它两因素之间作用并不明显。在等高线图的中心区域和3D图中的最高点可以得到一个理论最大值，这与方差分析结果一致。

图3 两因素相互作用影响牡丹籽壳总黄酮得率的响应面效果

2.3.3 最佳工艺条件的确定及验证 根据牡丹籽壳总黄酮响应面法实验结果，可得到最佳提取条件下总黄酮得率预测值为1.44%，即乙醇浓度、超声功率、提取温度分别为52.17%、124.12 W、51.95 ℃。考虑实际可操作性，将最优提取条件调整为60%、120 W、50 ℃，最终黄酮实际得率为1.43%，预测值与实测值差异不大，且工艺稳定性在重复性实验下证明有一定可靠性，表明此响应面优化法对牡丹籽壳总黄酮的提取有参考价值。

2.4 抑菌活性测定结果

由表5可以看出，牡丹籽壳黄酮提取物对七种病原菌的生长均有抑制作用，且抑菌活性之间因不同浓度提取物、不同的菌种存在较大的差异。其中牡丹籽壳黄酮提取物对小麦赤霉病菌和甘蓝黑斑病菌的抑制活性最好，EC50值均小于30 mg·L-1，分别为21.39 mg·L-1和27.41 mg·L-1。苹果炭疽病菌和水稻纹枯病菌的EC50值均小于40 mg·L-1；苹果腐烂病菌和番茄灰霉病菌的EC50值均大于45 mg·L-1，这两种病菌的抑制活性较低；对油菜菌核病菌的抑菌活性最差(EC50值为58.42 mg·L-1)。最终可得，牡丹籽壳黄酮提取物对这七种植物源病菌的抑制活性从高到低依次为小麦赤霉病菌、甘蓝黑斑病菌、水稻纹枯病菌、苹果炭疽病菌、番茄灰霉病菌、苹果腐烂病菌、油菜菌核病菌。

表5 牡丹籽壳黄酮提取物对七种供试真菌的抑制毒力测定结果

3 结 论

研究通过醇提法对牡丹籽壳中的黄酮类物质进行了提取，通过响应面法优化了单因素实验的提取工艺。在考虑实验可操作性的前提下，调整最佳提取工艺条件为：60%的乙醇浓度、120 W的超声功率、50 ℃的提取温度，实测牡丹籽壳总黄酮的得率为1.431%，其实际值与理论值差异不大，进一步证明了响应面法优化提取条件的可靠性。此外，牡丹籽壳总黄酮提取物对七种农用病原菌均有一定的抑制作用，特别是对小麦赤霉病菌和甘蓝黑斑病菌的抑制活性最好，它们的EC50值均小于30 mg·L-1。