大鼠脊髓背角内吗啡肽2的表达与骨癌痛的相关性*

牛乐 岳江涛 冯凯隆 梅江涛 贾晓康 戴先文

(西安市长安医院骨科，陕西 西安 710016)

临床上40%的癌症骨转移患者会出现严重的骨癌痛(bone cancer pain, BCP)。BCP慢性迁延，逐渐加重，许多患者因病情恶化出现焦虑、失眠及抑郁，甚至自杀倾向，临床上针对BCP尚缺乏安全有效的药物干预和治疗手段[1-2]。BCP严重影响患者的生存质量，因而阐明其病理生理机制，研发特效镇痛药及新型治疗方法迫在眉睫[3]。内吗啡肽2(endomorphin-2, EM2)是μ型阿片受体(mu-opioid receptor, MOR)的内源性配体和吗啡的内源性类似物，具有比吗啡更强的镇痛作用，而副作用极小[4-6]。脊髓背角是痛觉传递的闸门和初级中枢，来源于背根节神经元的EM2浓集分布于脊髓背角。脊髓水平EM2在神经病理性痛的调控中发挥着极为关键的作用[7-8]。BCP被公认是一种神经病理性痛，但以往缺乏报道BCP与脊髓EM2的关联性。本实验以BCP大鼠模型为工具，以脊髓背角为靶点，综合运用形态学、生物化学、痛觉行为学及药理行为学等方法研究脊髓背角EM2的表达变化及其与BCP行为的关联性，从全新的角度探寻BCP的发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年SPF级雄性SD大鼠30只，购自于空军军医大学实验动物中心，体质量200～220 g。本实验一切操作均遵循德国齐默尔曼教授提倡的善待实验动物国际公约[9]，并经医院伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 30只大鼠随机分为骨癌痛(BCP)组，假手术(sham)组和空白对照组，每组10只。空白对照组不经任何处理，BCP组在大鼠胫骨上端骨髓腔内注入Walker256癌细胞造模，sham组在胫骨相同部位注射等量无菌生理盐水。

1.2.2 实验设计 每组大鼠在骨髓腔注射癌细胞之前及之后的3、5、7、10、14、17、21 d先进行痛觉行为学检测，然后在以上各个时间点利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)和免疫组化染色检测脊髓EM2的表达变化。在BCP大鼠痛觉阈值最低的时间点进行行为药理学检测，即经椎管鞘内注入不同剂量的吗啡、EM2或μ型阿片受体拮抗剂β-FNA，然后记录痛觉阈值的变化。

1.2.3 建立动物模型 骨癌痛模型建立[10-12]:参照以往经典造模方法，经腹腔注射2%戊巴比妥(50 mg/kg)浅麻醉大鼠，局部碘伏消毒，取左侧胫骨上端0.5 cm纵行切口，顿性分离皮下组织，暴露胫骨粗隆，10 mL注射器针头与骨面呈45°向远心端方向穿刺打孔，用微量进样器抽取Walker256癌细胞悬液10 μL，由穿刺孔将癌细胞缓慢注射至骨髓腔内，出针后迅速用骨蜡封闭骨孔，稀释碘伏液及无菌生理盐水冲洗伤口3遍，缝合后外涂红霉素软膏。空白对照组不经任何处理，sham组与BCP组采用相同的麻醉和手术方式，最后在胫骨骨髓腔内注射等量无菌生理盐水。造模后14天，取大鼠胫骨组织行HE染色，鉴定癌细胞对骨质破坏情况。

1.2.4 痛觉阈值检测 将大鼠置于铁丝网之上，透明有机玻璃罩之内，适应15 min，然后以von Frey纤维丝(购自美国Stoelting公司)由弱到强刺激足底，每个刺激强度重复10次，出现5次以上缩足反射视为阳性反应，痛觉阈值为出现阳性反应的最小刺激强度[13-14]。

1.2.5 HPLC量化分析EM2表达量 高效液相色谱法(HPLC) 至今尚未发现编码EM2的RNA及DNA，且EM2只是四肽，分子量极小，不足1 kDa，无法使用实时定量PCR或者Western blot的方法定量分析,只能用HPLC量化分析EM2表达量。深麻动物，迅速取出脊髓腰膨大节段，液氮冻存; 裂解液与组织块混合，经超声裂解，超高速离心后取上清。Hypersil ODS 填料色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm,购自美国 Termo Electron 公司)，柱温 40℃；进样量 10 μL，流动相：甲醇-0.1%三乙胺溶液(65∶35)，流速：1.0 mL/min，检测波长：570 nm[15]。

1.2.6 免疫组化染色 深麻大鼠，暴露心脏，剪开右心耳放血，插管至主动脉，先以磷酸缓冲液(PB)冲洗组织内残留血液，再以4%多聚甲醛灌注固定30 min。随后切取脊髓腰膨大节段，移入含30%蔗糖的PB过夜。恒冷切片机切片，片厚25 μm。磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗切片3次，用兔抗EM2 IgG(AB5104, 1∶200; 免疫组化试剂购自美国Chemicon公司)室温下孵育切片12 h；生物素化的二抗室温孵育6 h；A、B混合液(1∶200) 室温孵育2 h。上述各免疫反应步骤之间均用PBS彻底漂洗，最后以0.05% DAB呈色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片，显微镜摄片。

1.2.7 行为药理学 鞘内置管：BCP组，经腹腔注射2%戊巴比妥(50 mg/kg)浅麻醉大鼠，局部碘伏消毒，在第4或5胸椎水平沿棘突取0.5 cm纵行切口，顿性分离皮下组织，暴露椎骨，咬去小部分椎板，剪开硬脊膜，将PE-10细导管插入蛛网膜下腔，导管直达腰膨大(L5～L6节段)处，见有脑脊液流出，灼烧封闭导管外口，稀释碘伏液及无菌生理盐水冲洗伤口3遍，缝合后外涂红霉素软膏。若大鼠清醒后后肢无运动障碍，并且以2%利多卡因鞘内注射，双后肢在5秒内瘫软，即为置管成功[16-17]。鞘内给药：BCP组，鞘内给与吗啡(0.3、1、3、10 μg)、EM2 (0.3、1、3、10 μg)或β-FNA (1、10 μg)，溶剂对照组给予相当量的无菌生理盐水，然后检测痛觉阈值。

2 结果

2.1 BCP大鼠形成了显著的机械性异常疼痛 5天时，与sham组(26.2±1.6)g和空白对照组(25.8±1.7)g相比，BCP组痛觉阈值在胫骨骨髓腔移植肿瘤细胞后显著降低(14.8±1.9 )g，14天时达到最低值(5.3±1.4 )g，即形成了显著的机械性异常疼痛，并且14天之后最低值一直维持下去；而sham组和空白对照组痛觉阈值在造模前和造模后无明显变化 (P<0.05)，见图1。HE染色观察到sham组大鼠胫骨骨质致密，结构完整，而BCP组大鼠胫骨骨质出现了明显的侵蚀性破坏(图2) 。

图1 骨癌痛大鼠出现了显著的机械性异常疼痛

图2 HE染色示骨癌痛大鼠胫骨出现明显的骨质破坏

2.2 BCP大鼠脊髓EM2显著减少，与痛觉阈值的降低呈正相关 与sham组和空白对照组相比，BCP组脊髓背角EM2的染色密度显著减低，EM2免疫组化阳性结构集中在脊髓背角浅层(图3A)。HPLC检测显示，5天时，与sham组 (80±4.8 ng/mg)和空白对照组 (82±4.2 ng/mg)相比，BCP组脊髓EM2的表达在造模后出现了显著减少(52±7.3) ng/mg，14天时减少到最低水平(23±3.6 ng/mg)，并且14天之后最低水平一直维持下去(P<0.05)，见图3B。在BCP组，痛觉阈值的降低与EM2的表达减少呈显著的正相关 (r=0.963，P<0.001)，见图3C。以上结果提示BCP大鼠脊髓背角EM2的表达下调对于痛觉信息的调控至关重要。

图3 大鼠脊髓EM2显著减少，与痛觉阈值的降低密切关联

2.3 脊髓EM2低表达导致了BCP痛敏状态的形成 在BCP组痛觉阈值的最低点，即造模后14 天，经鞘内给予吗啡或EM2都能剂量依赖地产生镇痛作用(图4A、B)，但与相当剂量的吗啡相比，EM2能产生更强的镇痛作用(图4C)，而鞘内给予μ型阿片受体拮抗剂β-FNA能够加深疼痛(图4D)。以上结果提示BCP大鼠脊髓背角EM2的表达下调导致内源性镇痛作用的减弱，最终增强疼痛信息传递，导致BCP组痛觉行为的形成。

图4 脊髓EM2低表达导致了骨癌痛的产生

3 讨论

许多恶性肿瘤，如肺癌、乳腺癌、前列腺癌等常伴有骨转移，导致骨质的侵蚀性破坏和骨癌痛(bone cancer pain，BCP)；BCP经久不愈，慢性迁延，常表现为异常疼痛、痛觉过敏或自发痛[1-3]。可待因、吗啡等阿片类镇痛药是临床上治疗BCP的常用药物，但这些药物会带来诸多不良反应，如便秘、呼吸抑制、恶心、呕吐等，长期使用容易产生耐受性和成瘾性[18-19]。BCP严重影响患者的生存质量，因而阐明其病理生理机制，研发特效镇痛药及新型治疗方法迫在眉睫[20]。以往对BCP的研究聚焦在外周神经末梢的病变，而本研究独辟蹊径，率先提出中枢脊髓水平EM2的表达降低导致了BCP的形成，为BCP的防治提供新的靶点和理论基础。

经大鼠胫骨上端骨髓腔内注入Walker 256癌细胞建立的BCP大鼠模型是国际公认的研究BCP的动物模型[10-12]。在本实验中，我们成功建立了该模型。在BCP组大鼠，癌细胞注入胫骨后大鼠出现了显著的机械性异常疼痛，并且疼痛稳定维持，而HE染色提示BCP组大鼠胫骨骨质出现了明显的侵蚀性破坏。

以往观点认为，外周神经末梢的炎性变性和神经突触内线粒体的病变是BCP发病的主要原因，然而近年来越来越多的学者认为中枢神经系统(大脑和脊髓)的病变对于BCP的发病同样起着至关重要的作用[21]。脊髓背角是痛觉传递的初级中枢和闸门。有学者发现BCP大鼠脊髓背角神经元的自发放电频率显著增加，同时脊髓背角谷氨酸转运体的表达显著下调，这说明骨癌痛状态下痛觉信息在脊髓水平的传递出现了中枢敏化和增强[22-23]。内吗啡肽(endomorphin，EM)是最新发现的内源性阿片肽，包括内吗啡肽1(endomorphin-1; EM1)和内吗啡肽2(endomorphin-2，EM2)。EM作为内源性物质，具有比吗啡更强的镇痛作用，而副作用极小[4-8]。EM2浓集分布于脊髓背角，脊髓EM2在神经病理性痛的诱导和维系中起着极为重要的作用，外周神经损伤可导致脊髓背角EM2的表达显著减少[24]，鞘内或全身注射EM2对神经病理性痛起到有效的镇痛作用[25]。本研究从新的切入点，即脊髓水平探索BCP的发病机理，发现BCP大鼠脊髓背角EM2的染色密度显著减小，表达水平显著下调，EM2的表达下调和痛觉阈值的减低呈显著正相关，经鞘内注射EM2能产生比吗啡更强的镇痛作用。

4 结论

脊髓背角EM2的表达下调导致了BCP大鼠痛敏状态的形成，从全新的角度诠释BCP形成的病理生理机制，为BCP诊疗提供了新的理论依据。