泡沫分离法纯化葫芦巴中薯蓣皂苷及抗氧化性的研究

王志娟 张 炜 甘文梅 乜世成 高 红 宋 林

(青海师范大学化学化工学院，西宁 810008)

葫芦巴(Trigonellafoenum-graeeum, L.)，又名大叶芸香草、香苜蓿，是一种生存力极强的一年生草本植物，系豆科植物蝶形花亚科[1]，它起源于南欧、西亚和地中海地区，自古以来被用作香料及调味剂[2]。葫芦巴种子具有祛寒除湿、温肾补阳、抗肿瘤、降血糖等多种药用价值，已被多版《中国药典》收录[3]。随着葫芦巴胶和葫芦巴薯蓣皂素资源的开发，葫芦巴被广泛应用于食品工业[4]。

葫芦巴种子中含有多种营养物质和活性成分，其中，薯蓣皂苷为主要化学成分[5]，具有舒筋活血、消食利水、脱敏、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等作用[6]。因薯蓣皂苷提取液中杂质较多，产品纯度低，需经纯化才能对其进行后续产品的开发。皂苷是一种优良的天然非离子型表面活性成分，具有亲水性的糖体和疏水性的皂苷元，因此具有良好的起泡性，泡沫分离法(foam separation)作为一种基于溶液中溶质组分间表面活性的差异进行分离的新型技术，因具有设备简单和适于大规模工业化生产等优点，已被成功应用于蛋白质、皂苷及中药有效成分的分离富集[7,8]。

本实验以利用超高压提取技术提取出的薯蓣皂苷溶液为原料，富集比和回收率作为评价指标，通过单因素实验及Box-Behnken响应面优化实验，确定出最佳条件，并对其体外抗氧化活性进行研究，为葫芦巴中薯蓣皂苷的药理活性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葫芦巴种子：西宁市九康药材市场 (经青海省食品药品检定所鉴定)；薯蓣皂苷标准品、无水乙醇(AR)、香草醛(AR)、高氯酸(AR)、冰醋酸(AR)。

GX-04多功能粉碎机，101A-1E 电热鼓风干燥箱，BSA224S-CW 电子天平，TU-1901 双光束紫外-可见分光光度计，IKA旋转蒸发仪，实验室自制泡沫分离装置如图1所示。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 葫芦巴中薯蓣皂苷泡沫分离的评价指标

采用香草醛-高氯酸显色法[9]对葫芦巴中薯蓣皂苷的浓度进行测定，分别按式(1)、式(2)计算葫芦巴中薯蓣皂苷的的回收率和富集比。

(1)

图1 泡沫分离装置图

(2)

式中：ρf、ρs为泡沫层、残留层中薯蓣皂苷的质量浓度/μg/mL，V0、Vs、Vf为原液、残留层、泡沫层的体积/mL。

1.2.3 泡沫分离葫芦巴中薯蓣皂苷单因素实验

1.2.3.1 上样浓度对泡沫分离薯蓣皂苷的影响

在装液量为350 mL，气速为500 mL/min，温度为30 ℃条件下进行泡沫分离操作，考察上样质量浓度在0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL时对泡沫分离薯蓣皂苷的影响。

1.2.3.2 温度对泡沫分离薯蓣皂苷的影响

在装液量为350 mL，气速为500 mL/min，上样质量浓度为0.04 mg/mL条件下进行泡沫分离操作，考察温度在25、30、35、40、45 ℃时对泡沫分离薯蓣皂苷的影响。

1.2.3.3 气速对泡沫分离薯蓣皂苷的影响

在装液量为350 mL，温度为30 ℃，上样质量浓度为0.04 mg/mL条件下进行泡沫分离操作，考察温度在350、400、450、500、550 mL/min时对泡沫分离薯蓣皂苷的影响。

1.2.3.4 装液量对泡沫分离薯蓣皂苷的影响

在气速为500 mL/min，温度为30 ℃，上样质量浓度为0.04 mg/mL条件下进行泡沫分离操作，考察装液量在350、350、350、350、350 mL时对泡沫分离薯蓣皂苷的影响。

1.2.4 Box-Behnken响应面优化实验

根据单因素实验结果，设计了以保压时间(A)、保压压力(B)、乙醇体积分数(C)、固液比(D)为因素，薯蓣皂苷的回收率和富集比为指标，采用响应面Box-Behnken中心组合实验设计优化方案，因素水平设计表见表1。

表1 因素水平设计表

1.2.5 体外抗氧化活性测定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力的测定

参考王雅等[10]的方法，将未纯化的提取液、纯化的提取液、VC分别稀释成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL溶液备用。取0.025 mg/mL DPPH 溶液2.5 mL与2.5 mL无水乙醇混合，测定溶液在 517 nm的吸光值(A0)；精确吸取上述不同质量浓度的待测液 2.5 mL与质量浓度0.025 mg/mL的 DPPH 溶液2.5 mL 混合，摇匀后放置30 min，测定上述溶液在最大吸收峰处吸光值(Ai)；精确吸取上述不同质量浓度的待测液2.5 mL，分别与2.5 mL 无水乙醇混合均匀后，测定各溶液在最大吸收峰波长处的吸光值(Aj)。按式(3)计算清除率。

(3)

1.2.5.2 羟自由基清除能力的测定

参考卢彬等[11]的方法，将未纯化的提取液、纯化的提取液、VC分别稀释成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL溶液备用。取待测液2 mL，然后精确加入2 mL水杨酸-乙醇溶液(9 mmol/L)，2 mL 硫酸亚铁溶液(9 mmol/L)，2 mL H2O2溶液(8.8 mmol/L)，混匀后在37 ℃下避光反应30 min，510 nm处测其吸光值(Ai)。同时将对照将2 mL H2O2溶液换成2 mL蒸馏水，测其吸光值(Aj)；空白组将2 mL样品溶液换成2 mL蒸馏水，测其吸光值(A0)。按式(4)计算清除率。

(4)

1.2.5.3 超氧阴离子清除能力的测定

参考卢彬等[12]的方法，将未纯化的提取液、纯化的提取液、VC分别稀释成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL溶液备用。取待测液1 mL，依次加入50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.2) 缓冲溶液4.5 mL，充分混匀之后在37 ℃的水浴中10 min后，移取0.4 mL邻苯三酚溶液并摇匀，当反应达到4 min后用1.0 mL浓盐酸终止反应(A1)。空白组将1 mL待测液换成1 mL蒸馏水，测其吸光值(A0)。按式(5)计算清除率。

(5)

1.2.5.4总还原能力的测定

参考欧阳凯等[13]的方法，将未纯化的提取液、纯化的提取液、VC分别稀释成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL溶液备用。取 1 mL待测液，依次加入pH 6.6，0.2 mol/L 的磷酸缓冲液 2.5 mL，1%铁氰化钾溶液 2.5 mL，混匀，50 ℃ 水浴 20 min，加入 10%三氯乙酸溶液2.5 mL，取2.5 mL 上清液，加入蒸馏水2.5 mL，10%三氯化铁溶液，700 nm 测定吸光度，以吸光值的大小来表示样品还原能力的大小。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 上样浓度对泡沫分离薯蓣皂苷的影响

上样浓度对泡沫分离薯蓣皂苷的影响如图2所示，富集比随浓度的增大而逐渐降低，而回收率随浓度的增大而逐渐升高。当溶液浓度较低时，泡沫稳定性较差，溶液黏度较小，泡沫持液率较低[14,15]，因此呈现富集比高而回收率低的现象。随着溶液浓度的不断增大泡沫稳定性逐渐提高，同时溶液的黏度不断增大，泡沫夹带率变高，液体不易回流[16]，因此回收率逐渐升高。

图2 浓度对泡沫分离薯蓣皂苷的影响

2.1.2 温度对泡沫分离薯蓣皂苷的影响

温度对泡沫分离薯蓣皂苷的影响如图3所示，富集比随温度的升高先增大后减小，回收率不断减小。当温度较低时，溶液黏度及泡沫稳定性高，泡沫具有较高持液率，因此回收率较高[17]。当温度较高时，泡沫持液率降低，泡沫层夹带的薯蓣皂苷含量降低，因此回收率降低[18]。

图3 温度对泡沫分离薯蓣皂苷的影响

2.1.3 气速对泡沫分离薯蓣皂苷的影响

气速对泡沫分离薯蓣皂苷的影响如图4所示，随着气速的增加，富集比不断降低，回收率先升高后降低。当气速较低时，泡沫在分离柱中停留的时间较长，气泡并聚、排液较充分，可携带出的薯蓣皂苷较少，因此富集比高，回收率低。当气速增大时，泡沫的生成速度及上升速度加快，持液率较高，因此，回收率升高[19]。

图4 气速对泡沫分离薯蓣皂苷的影响

图5 装液量对泡沫分离薯蓣皂苷的影响

2.1.4 装液量对泡沫分离薯蓣皂苷的影响

装液量对泡沫分离薯蓣皂苷的影响如图5所示，当装液量较少时，泡沫在分离柱中停留的时间较长，泡沫中携带的薯蓣皂苷较大程度上回流至原液中，因此，富集比升高。而当装液量增加时，泡沫的持液率较高，泡沫中的夹带液在回流前被鼓出来，因此，回收率升高[20]。

2.2 响应面优化实验结果

2.2.1 响应面实验设计和结果

选取浓度(A)、温度(B)、气速(C)、装液量(D)进行四因素三水平的Box-Behnken响应面实验设计，响应面实验设计及结果见表2。

表2 响应面实验设计及结果

2.2.2 回归模型的建立与检验

对表2进行多元线性回归拟合后，得到回归方程并对此方程进行方差分析，方差分析结果，富集比的线性回归表见表3和表回收率的线性回归表见4。富集比(E)=+1.85-0.83A+ 0.15B-0.52C-0.21D-0.040AB+0.32AC+0.21AD-0.017BC+0.070BD+0.080CD-1.083E-003A2-0.050B2+0.23C2+0.50D2；回收率(R)=+89.13+2.69A+1.96B+0.87C+1.19D-0.54AB-3.02AC-4.24AD+ 2.62BC-6.70BD-5.33CD-1.50A2-6.80B2-1.89C2-3.11D2。

表3 富集比的线性回归表

表4 回收率的线性回归表

2.2.3 响应曲面分析及最佳工艺条件的确定

利用Design-Experter 8.0.6软件对葫芦巴中薯蓣皂苷的纯化工艺条件进行优化，得到最佳纯化工艺参数为：上样浓度0.03 mg/mL，温度28.36 ℃，气速450 mL/min，装液量400 mL，在此条件下，薯蓣皂苷的回收率为88.31%，富集比为3.65。为验证预测模型的可靠性，从实际情况出发，将最佳工艺条件进行调整：上样质量浓度0.03 mg/mL，温度28 ℃，气速450 mL/min，装液量400 mL。在此条件下，薯蓣皂苷的回收率为86.57%，富集比为3.82，接近其预测值，说明由Design-Expert 8.0.6设计软件得到的最佳工艺条件可行。

2.3 体外抗氧化活性分析

2.3.1 薯蓣皂苷对DPPH自由基的清除能力

图6 薯蓣皂苷对DPPH自由基的清除能力

薯蓣皂苷对DPPH自由基的清除能力如图6所示，未纯化的薯蓣皂苷、纯化后的薯蓣皂苷、VC对DPPH自由基的清除能力随而增强，与李霄等[21]的结论一致。在0.01～0.05 mg/mL范围内，VC对DPPH自由基的清除率最高，但当溶液质量浓度达0.05 mg/mL时，纯化后的薯蓣皂苷对DPPH自由基的清除效果与VC相接近。

2.3.2 薯蓣皂苷对羟自由基的清除能力

薯蓣皂苷对羟自由基的清除能力如图7所示，在0.02～0.04 mg/mL范围内，未纯化的薯蓣皂苷与纯化后的薯蓣皂苷对羟自由基的清除效果相接近，与VC相比略低。

图7 薯蓣皂苷对羟自由基的清除能力

2.3.3 薯蓣皂苷对超氧阴离子的清除能力

薯蓣皂苷对超氧阴离子的清除能力如图8所示，薯蓣皂苷对超氧阴离子的清除能力随浓度的增大而增加，这与王占一等[22]的研究结果一致。但在所测浓度范围内，VC对超氧阴离子的清除效果明显高于薯蓣皂苷。

图8 薯蓣皂苷对超氧阴离子的清除能力

图9 薯蓣皂苷的总还原能力

2.3.4 薯蓣皂苷的总还原能力

薯蓣皂苷的总还原能力如图9所示，在较低浓度时，纯化后的薯蓣皂苷与VC的总还原能力极其吻合。吸光度值越大，表明总还原能力越强，薯蓣皂苷的总还原能力随浓度的增大而增加，这与邹小灵等[23]的研究结果一致。当纯化后的薯蓣皂苷质量浓度达到0.04 mg/mL，总还原能力趋于平缓，低于VC但高于未纯化的薯蓣皂苷。

薯蓣皂苷的总还原能力如图10所示，在较低浓度时，纯化后的薯蓣皂苷与VC的总还原能力极其吻合。吸光度值越大，表明总还原能力越强，薯蓣皂苷的总还原能力随浓度的增大而增加，这与邹小灵等[23]的研究结果一致。当纯化后的薯蓣皂苷浓度达到0.04 mg/mL，总还原能力趋于平缓，低于VC但高于未纯化的薯蓣皂苷。

3 结论

本实验以葫芦巴中薯蓣皂苷为研究对象，采用响应面设计试验优化泡沫分离法纯化葫芦巴中薯蓣皂苷的工艺条件，得出最佳工艺条件为：上样质量浓度0.03 mg/mL，温度28 ℃，气速450 mL/min，装液量400 mL，在此条件下，薯蓣皂苷的回收率为86.57%，富集比为3.82。其体外抗氧化活性研究结果表明，经纯化后的薯蓣皂苷对DPPH·、·OH、超氧阴离子有较好的清除效果，具有较强的还原能力，且体外抗氧化活性与皂苷质量浓度相关性显著。