3个HLA-A新等位基因的序列分析及确认*

尚利侠 齐珺 武君华 陈乐 王满妮 王小芳 房婕 王天菊

人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）是目前所知人体最复杂、最具多态性的基因遗传系统，位于第6号染色体短臂，具有高度的遗传多态性，在同种异体组织器官移植及移植物的急性排斥反应中起重要作用。近年来，随着DNA测序技术的快速发展，新的等位基因不断被发现。我们在对2018年中国造血干细胞捐献者资料库陕西分库入库样本进行A/B/C/DRB1/DQB1位点常规检测时，发现3个样本HLA-A位点疑似新等位基因，对这3个样本采用基于ION S5TM平台的下一代测序技术（Next Generation sequencing, NGS）进行鉴定，经向世界卫生组织提交相关信息后，于2019年3月30日被WHO HLA因子命名委员会分别正式命名为HLA-A*02:897、HLAA*02:898、HLA-A*02:899。

材料与方法

1 标本来源 2018年中华骨髓库陕西分库造血干细胞志愿捐献者。先证者一为陕西籍、汉族、女性、32岁；先证者二为陕西籍、汉族、女性、19岁；先证者三为青海籍、蒙古族、女性、20岁。

2 主要试剂和仪器

2.1 主要试剂：北京天根血液基因组DNA提取试剂盒（批号：R7229北京TIANGEN）；SeCore®HLASBT分型试剂（批号：006、007、005、005、006美国One Lambda 公司）；NXTypeTMNGS测序试剂（批号：LOT 002 美国One Lambda 公司）。

2.2 主要仪器：生物安全柜（型号BC-1000ⅡA，苏州安泰空气技术有限公司）；核酸检测仪（型号Gene Quant pro，Biochrom公司）；PCR扩增仪（型号SENSO QUEST，圣欧国际有限公司）；DNA测序分析仪（型号3730xl，美国ABI公司）；ION S5TM测序仪（美国One Lambda 公司）。

3 方法

3.1 标本采集和基因组DNA的提取：采集志愿捐献者外周静脉血5 mL（EDTA抗凝），采用北京天根血液基因组DNA提取试剂盒，严格按照试剂盒操作说明提取DNA，应用Gene Quant核酸蛋白检测仪测定浓度和纯度。

3.2 PCR-SBT（Sanger测序）：严格按照SeCore®HLA-SBT分型试剂盒说明书对提取的DNA进行测序分析。参照王天菊等[1-2]提及的方法。电泳序列导入uTYPE®（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）分析软件进行分析后发现，样本1相对于HLAA*02:01，02:07:01，第3外显子520位有一个碱基差异；样本2相对于HLA-A*02:06，33:03，在第4外显子641位有一个碱基差异；样本3相对于HLAA*02:01:01，02:01:01，第4外显子652位有一个碱基差异。

3.3 PCR-SBT（Sanger测序）：进一步采用NGS方法对3个样本进行分析，以确认碱基变异以及变异的具体位置。二代测序主要分为文库制备，模板制备，测序反应和数据分析三大步骤。① 文库制备：测定DNA浓度后均一化，采用Thermo Fisher Scientific的NXTypeTM NGS试剂扩增。扩增产物浓度均一化，将处理好的产物片段化，接头连接，末端修复，加标签，磁珠纯化选择目标片段。二次扩增，纯化和定量后，将产物进行等摩尔混合。② 模板制备：制备好的文库进行单克隆扩增。③ 测序反应和数据分析：将扩增产物加载至芯片上，在Ion S5测序平台上加入4种脱氧核苷酸，开始测序反应，采用Type Stream Visual软件指定HLA-A/B/C/DRB1/DQB1/DPB1等位点基因型。

结 果

1 PCR-SBT（Sange测序）分型结果 将序列导入uTYPE®分析软件发现，3例样本A位点首次直接测序结果与目前所有已知A位点等位基因序列均不完全一致。样本1相对于其同源性最高的杂合序列HLAA*02:01，02:07:01，第3外显子区域520位有一个碱基变异（见图1A）；样本2相对于其同源性最高的杂合序列HLA-A*02:06，33:03在第4外显子区域641位有一个碱基变异（见图1B）；样本3相对于其同源性最高的等位基因组合HLA-A*02:01:01，02:01:01，第4外显子区域652位有一个碱基变异（见图1C），经二次复核，3例样本A位点测序结果均与第一次相同。为了明确变异碱基位于哪个等位基因，进一步用NGS方法进行分析。

图1A 样本1 HLA-A位点测序结果；图1B 样本2 A位点测序结果；图1C 样本3 A位点测序结果

2 NGS结果 NGS对HLA I类位点全长进行测序，发现3例样本均携带1个HLA-A新等位基因。样本1与同源性最高的A* 02:07:01:01相比，在第3外显子520位置发生了G＞A碱基变异，导致第174密码子由GCC＞ACC，氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸（Ala＞Thr）；样本2与同源性最高的A*02:06:01:01相比，在第4外显子641置位发生C＞T碱基变异，导致第214密码子由ACT＞ATT，氨基酸由苏氨酸变成异亮氨酸（Thr＞Ile）；样本3与同源性最高的A*02:01:01:01相比，在第4外显子652位置发生了G＞C碱基变异，导致第218位密码子由GTC＞CTC，氨基酸由缬氨酸变成亮氨酸（Val＞Leu）。新等位基因与其同源性最高的等位基因部分核苷酸比对见图2。

图2 未知等位基因与同源等位基因部分核苷酸比对，差异核苷酸位置如箭头所示

3 新等位基因确认及命名 将3例样本的NGS单链序列提交给Genbank，得到的Bankit ID及相关数据上报给WHO HLA因子命名委员，于2019年9月30日被WHO HLA因子命名委员会分别正式命名为HLA-A*02:897（HWS10056319）、HLAA*02:898（HWS10056321）、HLA-A*02:899（HWS10053323）。

4 3例样本HLA-A/B/C/DRB1/DQB1/DPB1位点高分辨确认分型结果 经SBT（Sanger测序）分型和NGS二次确认，3例样本基因型如表1。

表1 3例样本高分辨分型结果

讨 论

HLA-A是HLA-I类基因，编码的蛋白质产物以糖蛋白的形式几乎表达在所有有核细胞表面。HLA-I类分子的重链（α链）胞外段有三个结构域（α1、α2、α3），其中α1、α2两个结构域共同组成抗原结合槽，α3及β2-m属于免疫球蛋白超家族结构（IgSF）域。已经证实HLA-I类基因的第2、3、4外显子分别编码α链的α1、α2、α3结构域，本次实验中确认的新等位基因A*02:897与A*02:07:01相比，在第3外显子520位发生G＞A碱基变异，导致第174位氨基酸由丙氨酸（AIa）变为苏氨酸（Thr）,α2结构域氨基酸的改变可能会影响抗原结合的特异性以及TCR识别作用，从而引起不同的免疫应答；A*02:898与A*02:06:01相比，在第4外显子641位发生了1个碱基变异，导致第214位氨基酸由苏氨酸（Thr）变为异亮氨酸（Ile）；A*02:899与A*02:01:01相比，在第4外显子652位发生了1个碱基变异，导致第218位氨基酸由缬氨酸（Val）变为亮氨酸（Leu）而这两个变异均位于α3结构域，推测该变异更多的影响HLA分子的稳定性，是否会引起HLA分子表达量的改变，是我们后续的研究方向。

目前，应用于临床HLA的检测方法主要有序列特异性寡核苷酸探针、序列特异性引物、PCR-SBT、NGS等[3-5]。PCR-SBT被誉为HLA基因分型的金标准，随着等位基因数量的增加，同一位点不同等位基因序列碱基差异越来越小，造成检测区分难度相对增加。等位基因同源性以及扩增区域等限制性因素的影响，测序结果存在多种等位基因组合在检测区域内具有相同的杂合序列，模棱两可组合出现越来越多[6-7]。在HLA PCR-SBT分型过程中存在模棱两可组合时，需要通过增加检测外显子测序范围、组特异性引物单链扩增、特异性引物测序、NGS等方法进一步区分。本文中3例样本在使用PCR-SBT（Sanger法）检测时，HLA-A位点均发生了碱基变异，但无法确认变异碱基位于哪一条染色体上，当用原方法复试排除了人为因素及实验误差的影响后，我们采用了NGS测序，得到了新等位基因的碱基序列，从而鉴定了3个HLA-A新等位基因。NGS采用了大规模矩阵结构的微阵列分析技术，将所有短的单体型DNA片段序列与数据可参考序列比对，通过拟合计算，拼接成完整的全长序列。NGS技术应用于HLA等位基因测序主要有两个优势，第一，针对HLA单链测序，分别得到特定单一等位基因序列，很大程度上减少了模棱两可的结果；第二，NGS技术检测区域更广、相位分明，在HLA高分辨分型中鉴定出大量的新等位基因和罕见等位基因，极大丰富了人类HLA数据库及其多态性，也为选择最适供者提供更多信息。

截至2021年1月, HLA-A位点的等位基因数目已达6 425个，其中HLA-A*02家族包含了1 410个等位基因（A*02:01:01:01-A*02:954)，为多态性最高的等位基因家族，在不同地区和种族中的分布存在较大差异。世界三大主要人种的HLA-A*02等位基因的频率分别为：北美高加索人0.289 5，北美黑人0.185 7，东方人0.335 5[8]。在中国人中HLA-A*02更为常见，且南北方差异不大，南方汉族0.337 0，北方汉族0.367 0，西安地区汉族0.300 3[9]。自本实验室2010年开展对HLA进行SBT检测以来，在对17 000份造血干细胞捐献者的检测中未发现A*02:897、A*02:898、A*02:899的其他个体，所以推测这三个等位基因为罕见型，下一步将对先证者进行家系调查，明确新等位基因是属于稳定遗传还是个体变异，以及新等位基因所在的单体型、座位间连锁情况及其地域性、遗传情况等，进一步深入研究新等位基因在人群中的频率分布及功能。

近年来，随着HLA分型技术的广泛应用和中华骨髓库的不断壮大，新的HLA等位基因不断被发现和报道。新基因的发现，扩大了HLA遗传系统的多样性，丰富了HLA数据库，为需要进行器官移植和造血干细胞移植的患者找到更适宜的供者，减少急性排斥反应的发生，提高了移植存活率；同时也为研究HLA与疾病相关性、亲子鉴定、个体识别以及群体遗传学等提供必需的基本数据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突