继发性噬血细胞综合征患者NK细胞KIR受体及功能与CTL细胞功能的研究*

梅仁 蔡梦洁 戴兰 沈文红 朱明清

噬血细胞综合征（HLH）被认为是一种淋巴单核巨噬细胞系统反应增生的组织细胞病，主要是由于杀伤性T细胞（CTL）及NK细胞功能缺陷导致抗原清除障碍，刺激巨噬细胞活化增殖，分泌大量炎症细胞因子而导致的一组临床综合征[1]。噬血细胞综合征主要分为两种，原发性（遗传性）存在明确基因缺陷或家族史，为常染色体隐性遗传或X连锁遗传，常见的基因有PRF1基因；继发性可由感染（主要为EB病毒感染）、恶性肿瘤、自身免疫性疾病、药物、获得性免疫缺陷（如移植）等多种因素引起[2]。目前诊断主要参照国际组织细胞协会2004年修订标准[3]。HLH的诊断比较复杂，临床表现不典型，特异性差，诊断难度大。因此，探求有效诊断方式，及时采取干预措施以减少预后风险极为重要。研究表明，HLH患者的NK细胞功能和CTL细胞功能存在缺陷[4-5]。本文旨在探索NK细胞功能和CTL细胞功能在辅助诊断继发性噬血细胞综合征中的作用，为临床早发现、早诊断、早治疗提供参考依据。

资料与方法

1 一般资料 选取苏州大学附属第一医院2018年2月～2021年2月收治的26例继发性HLH患者。入选标准：符合国际组织细胞协会制定的2004年诊断标准[3]。26例患者男性18例，女性8例，中位年龄45岁。同期选择17例在我院门诊接受体检的健康者作为对照组，男性12例，女性5例，中位年龄41岁。本研究通过院伦理委员会审批。

2 试剂及仪器 仪器采用Navios流式细胞仪（Beckman coulter公司），离心机，涡旋振荡仪等。单抗：CD3-ECD、CD56-PC7、CD8-APC（Beckman coulter公司）、CD158a-PCP5.5（Invitrogen）、CD158b-FITC（Novus Biologicals）、CD158e-PE（mitengi Biotec）、CD158i-APC（Novus Biologicals）、Perforin-FITC（BD Pharmingen）、GranzymeB-PE（BD Pharmingen），氯化铵溶血剂（QIAGEN公司），破膜剂Intracell（Dako公司）。

3 方法 以EDTA-K2抗凝管采集患者外周血2 mL，1管取100 μL外周血加入CD3，CD56，CD158a，CD158b，CD158e，CD158i抗体各5 μL混匀，室温避光孵育15 min，溶血剂溶血，加2 mL PBS，1500 rpm离心洗涤5 min，弃上清，加500 μL PBS悬浮，上机分析。2管取100 μL外周血加CD3，CD56，CD8抗体各5 μL混匀，室温避光孵育15 min，加固定剂A 100 μL，混匀，室温避光固定15 min，加2 mL PBS，1 500 r/min离心洗涤5 min，弃上清，震荡悬浮细胞，加破膜剂B 100 μL，打孔5 min，加Perforin和Granzyme B抗体各2 μL，混匀，室温避光孵育15 min，加2 mL PBS，1 500 r/min离心洗涤5 min，弃上清，加500 μL PBS悬浮，上机分析。

4 统计学处理 若数据为非正态分布，采用非参数Mann-Whitney秩和检验，以四分位数法表示。若数据为正态分布，则采用T检验进行分析，结果以平均值±标准差表示。运用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析和绘图。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 继发性 HLH患者淋巴细胞的比例变化 检测继发性HLH组和对照组淋巴细胞各组分比例，对照组淋巴细胞比例为（33.2±1.9）%，T细胞比例为65.2（54.8，71.1）%，NK细胞比例为（20.4±2.1）%，CTL细胞比例为35.2（30.2，37.9）%。而继发性HLH组淋巴细胞比例为（18.4±2.4）%，T细胞比例为71.6（45.825，80.65）%，NK细胞比例为（7.7±1.6）%，CTL细胞比例为45.5（35.275，50.375）%。结果显示，与对照组相比，继发性HLH组淋巴细胞、NK细胞的比例显著降低（P＜0.000 1，图1A；P＜0.000 1，图1B），CTL细胞比例显著增高（P=0.005），且具有统计学差异。但是，继发性HLH组和对照组T淋巴细胞比例无显著差异（P=0.513）。

图1 对照组与继发性HLH组淋巴细胞和NK细胞比例比较

2 NK细胞KIR以及穿孔素和颗粒酶B表达情况 由于对照组和继发性HLH组NK细胞具有显著差异，为进一步研究NK细胞功能在继发性HLH中的作用，我们通过流式细胞术对两组NK细胞的杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）以及穿孔素和颗粒酶B的表达水平进行检测。流式细胞术结果显示，继发性HLH组KIR限制性表达率低于对照组（对照组：0/17，HLH组：7/26，P=0.031 0）。穿孔素和颗粒酶B表达情况不符合正态分布，对照组穿孔素四分位数法比例为96.6（95.1，97.8）%，继发性HLH组穿孔素表达比例为93（67.35，97）%，P=0.016 5；继发性HLH组NK细胞颗粒酶B四分位数法比例为85（72.125，92.75）%，略高于对照组83.8（80.6，89）%，P=0.871 7，无统计学意义。

3 CTL细胞穿孔素和颗粒酶B表达情况 由于对照组和继发性HLH组CTL细胞具有明显差异，为进一步研究CTL细胞在继发性HLH中的作用，我们通过流式细胞术对两组CTL细胞穿孔素和颗粒酶B的表达水平进行检测。结果显示，继发性HLH组穿孔素比例为（45.34+5.38）%，略高于对照组比例（37.49+5.03）%；继发性HLH组颗粒酶B比例为（49.31+5.97）%，略高于对照组比例为（45.18+4.67）%。两组数据比较均无统计学意义（穿孔素：P=0.3207，图2C；颗粒酶B：P=0.6219，图2D）。

图2 对照组与继发性HLH组CTL细胞穿孔素与颗粒酶B表达比例比较

讨 论

HLH是一种因淋巴细胞或组织细胞过度增生引发无效免疫应答，致使多个器官出现高炎症反应的临床综合征，可发生于各个年龄段，病情进展迅速，预后较差。若未及时有效治疗，可直接危及生命，病死率相对较高[6]。研究表明，经过不同方案治疗的成人HLH患者30 d死亡率为20%～44%，总死亡率为50%～75%，肿瘤相关HLH的预后相对更差[7-8]。HLH主要特征为全血细胞减少，持续发热，肝脾肿大，高血清铁蛋白，高甘油三酯，低纤维蛋白原，并可在骨髓、肝、脾、淋巴结组织发现噬血现象。HLH-2004诊断标准补充说明：无论儿童或成人患者，HLH-2004诊断指南都是目前临床诊断HLH应该遵循的原则。2018 HLH诊治中国专家共识中提到运用流式细胞技术检测NK细胞杀伤活性，到目前为止，国内外对NK细胞活性的检测方法尚没有统一规定，有待完善，而NK细胞的活性与其受体和功能有关[9-10]。本研究运用流式细胞技术检测继发性HLH患者NK细胞KIR受体及穿孔素和颗粒酶B表达的变化，以此判断是否可以通过此项检查来辅助诊断继发性HLH。

NK细胞在机体中主要起抗肿瘤和抗病毒效应，在天然免疫和获得性免疫中均发挥重要作用[11]。NK细胞活性受其表面多种调节性受体的调控，根据功能可以分为活化性受体和抑制性受体两大类。研究发现，KIR除了发挥抑制性受体作用阻遏杀伤功能外，还具有激活杀伤细胞的作用，其通过识别表达于靶细胞的HLA-I类分子来调节NK细胞的杀伤活性。正常情况下，活化性受体和抑制性受体表达水平处于平衡状态，共同调节NK细胞的活性，而表达水平一旦失衡，NK细胞的杀伤活性便会减弱[12-14]。NK细胞主要通过穿孔素及颗粒酶B介导的细胞杀伤及细胞毒性发挥作用，而一旦穿孔素和颗粒酶B的分泌水平不足，机体不能有效的清除病毒，持续的抗原刺激将导致淋巴细胞和组织细胞增殖并释放多种细胞因子（即“细胞因子风暴”），从而导致全身各个脏器功能受损，甚至死亡[15-16]。CTL细胞为CD8+T细胞活化后分化的效应细胞，其主要功能是特异性直接杀伤靶细胞，主要通过两种机制发挥细胞毒作用，其中一种也是分泌穿孔素和颗粒酶B等物质直接杀伤靶细胞，如果分泌水平不足，机体同样不能有效杀伤靶细胞[17]。

本研究结果显示，继发性HLH患者无论是淋巴细胞数量及比例，还是NK细胞数量及比例都明显低于正常人，说明继发性HLH患者体内NK细胞确实受到了一定程度的破坏。同时，本研究结果显示26例继发性HLH患者中存在7例患者NK细胞KIR受体限制性表达（仅仅表达其中一种受体），而其中4例患者都是表达抑制性受体（另外3例不在所检测试剂内），活化性受体缺失，从而抑制了NK细胞的活化，使其杀伤作用减弱。所以继发性HLH患者中部分患者NK细胞受体平衡状态受到了破坏，从而减弱了NK细胞的杀伤作用。而对于NK细胞和CTL细胞穿孔素和颗粒酶B的表达，结果显示都没有明显的降低，这与秦强等[18]的研究一致。另有文献报道[19]PRF1基因突变的原发性HLH，其NK细胞与CTL细胞的穿孔素表达明显降低，而本研究中继发性HLH患者穿孔素的表达未见明显变化，所以可以通过穿孔素的检测，快速鉴别PRF1基因突变引起的原发性HLH和继发性HLH。同时研究结果显示，HLH患者淋巴细胞数量降低（均值0.5×109/L），低于正常人参考值下限0.8×109/L，NK细胞比例严重降低，CTL细胞比例明显高于对照组，总体上NK细胞CTL细胞分泌穿孔素和颗粒酶B水平呈下降趋势，但其表达水平与对照组差异无显著意义，有待进一步研究其内在机制。

综合分析，继发性HLH患者仅仅存在淋巴细胞数量和比例的降低，而NK细胞和CTL细胞穿孔素和颗粒酶B的表达水平并没有下降。穿孔素的检测有可能作为临床鉴别PRF1基因突变引起的原发性HLH和继发性HLH的一个检测指标。但由于例数相对较少，需要进一步扩大样本量进行研究并加以验证。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突