发酵毛竹笋制备水溶性膳食纤维工艺优化及功能特性研究

吴丽萍，孙虹，朱婷婷，陈佳钰，蔡永久，胡晓倩

(黄山学院 生命与环境科学学院，安徽 黄山 245000)

毛竹属于禾本科、竹亚科、刚竹属多年生常绿植物[1]，毛竹笋是毛竹根茎上生长的嫩芽，富产于安徽黄山等地。毛竹笋在加工处理过程中产生大量笋尖、笋衣、笋壳等副产物，这些副产物中毛笋壳的膳食纤维(dietary fiber，DF)含量较高，达到30%～45%[2]。但是在实际生产中，毛竹笋壳并未得到合理利用，而被当作废弃物丢掉，造成了一定的资源浪费与环境污染。

膳食纤维(DF)是被称为“第七大营养素”的一种不能被人体消化的多糖[3]，根据其溶解性的不同，分为水溶性膳食纤维(soluble dietary fiber，SDF)和不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber，IDF)。其中SDF具有改善便秘和调节肠道菌群[4]、降血糖、降血脂等功效。资料表明，SDF含量达到10%以上，才被称为高品质膳食纤维[5]，而富含DF的毛竹笋壳仅含SDF 7%左右[6]，因此合理工艺提高水溶性膳食纤维含量才能真正变废为宝[7]，对推动我国农副产品的综合利用和应用具有重要意义[8]。

微生物发酵法是制备SDF的新型技术手段[9]，利用微生物产生的复杂酶系作用于农副产品底物原料，省略了酶的提取以及纯化过程，被广泛地应用于食品生产和加工过程中[10]。纤维素降解菌可直接用于纤维素降解，降解产物直接作为产能源菌的碳源,形成两菌共培养的情形[11]，在一定程度上可有效节约成本，因此在发酵法制备SDF中应用较多。黑曲霉为丝状真菌，在适宜发酵条件下会产生纤维素酶、半纤维素酶等酶系，可将底物大分子纤维素分解为小分子可溶性成分[12]，从而提高SDF含量。毛霉因含有丰富的胞外酶系，包含多种蛋白酶及纤维素酶[13]，可实现多种大分子物质的水解与转化[14]。谢欢等利用黑曲霉发酵制备豆渣SDF，SDF含量提高了7.19倍；潘进权等[15]利用毛霉发酵豆渣，显著提高了豆渣SDF含量。已有的研究报道表明，黑曲霉及毛霉在提高SDF提取率方面效果显著，但其发酵毛竹笋下脚料的研究却鲜见报道。因此，本研究以毛竹笋壳为原料，采用真菌发酵制备毛竹笋SDF，通过单因素试验、响应面法优化试验确定发酵法制备毛竹笋SDF的最佳工艺，并对发酵前后毛竹笋SDF的表面微观结构及功能特性进行分析和评价，以期为毛竹笋废弃物的深度开发以及SDF的品质提升提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

毛竹笋壳：市售毛竹笋下脚料；黑曲霉GXU003菌株：中国工业微生物菌种管理保藏中心；毛霉：实验室分离保藏；马铃薯、葡萄糖、琼脂、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4等试剂：均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HH-6型数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；800型离心分离机 北京医用离心机厂；BS-1E恒温振荡培养箱 江苏宏华仪器厂；MLS-3780-SV型高温高压灭菌锅 松下电器(中国)有限公司上海分公司；JEM-200CX型高分辨透射电镜 日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种培养1.3.1.1 菌种培养基的制备

斜面培养基：采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，马铃薯300 g、葡萄糖30 g、琼脂30 g、水1500 mL、pH值自然。

种子培养基：马铃薯300 g/L、葡萄糖30 g/L、酵母膏15 g/L、pH值自然、水1500 mL。

毛竹笋发酵培养基：毛竹笋壳粉末10 g、蒸馏水20 mL、(NH4)2SO42.68、KH2PO42.68、MgSO46.83。

1.3.1.2 种子液的制备

分别将菌株接种于斜面培养基，在28 ℃恒温培养箱中培养72 h，用无菌水冲淋斜面，制成浓度为108CFU/mL的孢子悬液。将孢子悬液按1 mL/100 mL接种于种子培养基上，150 r/min、28 ℃摇床培养72 h，菌丝体用4层纱布过滤，将种子液的浓度制成108CFU/mL。

1.3.2 毛竹笋发酵制备SDF工艺流程

毛竹笋发酵培养基→分别接入10%黑曲霉、毛霉种子液→摇床培养(150 r/min，72 h)→固液分离→上清液→95%乙醇溶液沉淀→离心(3000 r/min，20 min)→干燥→毛竹笋SDF。

1.3.3 SDF提取率的测定

(1)

式中：m1为发酵毛竹笋得到的SDF质量，g；m为发酵培养基中原毛竹笋的质量，g。

1.3.4 纤维素酶活力的测定

纤维素酶活力的测定参照CMC糖化力法[16]，纤维素酶活力单位(unit)的定义：在 37 ℃下，每1 min水解生成 1 g葡萄糖所需的酶量。

1.3.5 发酵法制备毛竹笋SDF单因素试验设计

1.3.5.1 菌种对SDF提取率的影响

将毛竹笋渣与水按1∶15(g/mL)混合，分别接种10%黑曲霉或毛霉，按照表1的培养条件摇床培养72 h，测定并计算发酵后SDF提取率及纤维素酶活力。

表1 不同真菌的培养条件Table 1 The culture conditions of different fungi

1.3.5.2 单因素对SDF提取率的影响

根据1.3.5.1菌种对SDF提取率的影响结果，选用优势菌种黑曲霉对毛竹笋进行发酵，研究各因素对毛竹笋SDF提取率的影响。在保证其他条件相同的情况下，分别选择菌种接种量(2%、6%、10%、14%、18%)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，g/mL)、发酵温度(16，22，28，34，40 ℃)、发酵时间(0，24，48，72，96，120 h)、发酵初始pH(3.0，4.0，5.0，6.0，7.0)进行研究，并采用SPSS 18.0对单因素试验结果进行分析。

1.3.6 响应面试验设计

以单因素试验结果为基础，选择对SDF提取率影响较大的料液比(A)、接种量(B)、发酵时间(C)为自变量，根据Box-Behnken试验设计原理，将SDF提取率设定为响应值，进行三因素三水平响应面优化试验设计，因素水平表见表2。通过Design Expert 8.0.6对数据进行回归分析，优化制取毛竹笋SDF的工艺条件，并预测最优工艺参数。该模型采用最小二乘法拟合二次多项方程：

表2 Box-Behnken试验设计Table 2 Box-Behnken test design

(2)

式中：Wi为响应值(SDF提取率)，%；β0为常数；βi为线性系数；βii为二次项系数；βij为两个因素间的交互作用系数；Xi和Xj为参数变量(A，B，C)。

1.3.7 发酵前后毛竹笋SDF理化性质的测定

1.3.7.1 持水力的测定

准确称取发酵前后毛竹笋SDF各1.0 g(m1)于烧杯中，加入 20 ℃ 的水浸泡60 min后抽滤，将滤纸转移到质量为m2的表面皿中称得质量m3，持水力按式(3)计算：

(3)

1.3.7.2 持油力的测定

准确称取发酵前后毛竹笋SDF各2.0 g(m1)的样品与20 mL花生油放置于50 mL 离心管中，振荡30 min，使之混合均匀，然后置于离心机内以1600 r/min的转速离心处理25 min，除去上层油液后，甩干称取的样品质量为m2，持油力按式(4)计算：

(4)

1.3.7.3 膨胀力的测定

准确称取发酵前后毛竹笋SDF各0.2 g(m)样品，置于刻度试管中并记录其体积V1，加入5.0 mL蒸馏水，混合均匀后在4 ℃条件下放置20 h，记录样品吸水后的体积V2，膨胀力按式(5)计算：

(5)

1.3.7.4 溶解性的测定

分别称取0.5 g发酵前后毛竹笋SDF于10 mL离心管中，加入5 mL蒸馏水，记为v，搅拌均匀后在室温下静置1 h，以3000 r/min离心10 min，收集上清液，在105 ℃烘干至恒重，称取质量m，溶解性按式(6)计算。

(6)

1.3.7.5 胆固醇吸附能力的测定

参考朱玉等[17]的方法进行胆固醇吸附能力的测定。

1.3.8 发酵前后毛竹笋SDF微观结构观察

将发酵前后毛竹笋SDF经干燥处理至质量恒定，置于载物台上，采用表面喷金处理提高其导电性。扫描测试电压为15 kV，放大倍数为5000×，通过扫描电镜观察毛竹笋SDF发酵前后的微观形态。

1.4 数据分析与处理

采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析，运用SPSS 18.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，并利用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 单因素结果分析

2.1.1 最佳菌种的确定

不同菌种对SDF提取率及纤维素酶活力的影响见图1。

图1 菌种对SDF提取率及纤维素酶活力的影响Fig.1 Effect of strains on the extraction rate of SDF and cellulose activity注：图中字母代表差异的显著性(P<0.05)，下同。

由图1可知，在适宜发酵条件下，毛霉、黑曲霉在发酵过程中均能产生纤维素酶，这与胡翠英研究所得到的结果一致。采用黑曲霉发酵所获得的SDF提取率为27.12%，纤维素酶活力为2526.3 U/g，均显著高于毛霉(P<0.05)。纤维素酶活力越高，可使纤维素大分子间的氢键断裂，部分IDF变成SDF，从而使SDF提取率增加[18]。因此，后续试验采用黑曲霉作为制取毛竹笋SDF的菌种。

续 表

2.1.2 黑曲霉接种量对SDF提取率的影响

由图2可知，黑曲霉接种量对SDF的提取率存在显著性影响(P<0.05)。SDF提取率随着黑曲霉接种量的增大呈现先升高后降低的趋势，在10%时达到最大值(26.50±0.36)%。当黑曲霉接种量不足时，黑曲霉代谢产生的纤维素酶较少，因此SDF提取率较低。而当黑曲霉接种量超过10%时，产生的菌体量增加，造成菌内竞争营养物质的局面，导致后期菌体生长所需营养不足[19]，从而SDF将被消耗，SDF提取率出现下降趋势。因此，确定黑曲霉接种量为10%比较适宜。

图2 黑曲霉接种量对SDF提取率的影响Fig.2 Effect of Aspergillus niger inoculation amount on the extraction rate of SDF

2.1.3 料液比对SDF提取率的影响

料液比对SDF提取率的影响见图3。

图3 料液比对SDF提取率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of SDF

由图3可知，随着加水量的增大，SDF提取率呈现先升高后降低的趋势，在料液比为1∶15(g/mL)时，SDF提取率达到最大，为(26.27±0.25)%。适量提高水的含量即提高溶解氧，可提高黑曲霉菌种的呼吸强度，从而使SDF提取率提高。当料液比较低时，溶液黏度大，溶液中的溶解氧降低，不利于菌丝体的生长。料液比超过1∶15(g/mL)之后SDF提取率反而降低，其原因可能是当培养基中的水分含量过多时，湿度加大，通气、散热效果易变差，培养基易结块成团而抑制微生物产酶[20]，从而降低SDF提取率。因此，较佳的发酵料液比控制在1∶15(g/mL)比较合适。

2.1.4 发酵温度对SDF提取率的影响

发酵温度对SDF提取率的影响见图4。

图4 发酵温度对SDF提取率的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on the extraction rate of SDF

由图4可知，随着温度的升高，SDF提取率呈现先升高后降低的趋势，在28 ℃达到最大值(25.93±0.25)%。分析原因可能是温度升高，促进黑曲霉菌种的生长，使其产酶率提高，从而提高了SDF提取率，这与闵钟熳等的研究结果类似；当温度高于28 ℃时，SDF提取率呈现下降趋势，可能是由于温度升高导致发酵菌种的活性受到抑制[21]。综上，发酵温度应控制在28 ℃比较适宜。

2.1.5 发酵初始pH 值对SDF提取率的影响

发酵初始pH值对SDF提取率的影响见图5。

图5 发酵初始pH 值对SDF提取率的影响Fig.5 Effect of initial pH value of fermentation on the extraction rate of SDF

由图5可知，当pH小于5.0时，SDF提取率随着pH值的增大呈现不断升高的趋势，pH为5.0时SDF提取率达到最大值(25.40±0.20)%。研究表明，pH值过高或过低不仅会影响菌种生长，还会影响酶本身的空间构象，使酶活力降低，从而使SDF提取率下降。当pH值大于5.0时，偏离最适pH环境，菌种生长速度减慢，SDF提取率呈现下降趋势。因此，选择pH 5.0作为发酵毛竹笋的适宜pH值，考虑到试验的高效性及方便性，pH值作为固定值，不作为响应面优化的考虑因素。

2.1.6 发酵时间对SDF提取率的影响

由图6可知，发酵时间对于SDF提取率存在显著性影响。随着发酵时间的延长，菌体量逐渐增多，产酶能力增加，SDF提取率随之升高，在发酵72 h时，SDF提取率达到(26.23±0.31)%。随着发酵时间的延长，黑曲霉发酵产生的纤维素酶增多，并对毛竹笋壳中的IDF进行降解，将其转化为SDF，故SDF提取率提高。发酵72 h后，培养基的基质营养消耗过快，无法提供增殖所需的营养物质，抑制了菌体的大量增长，SDF分解为小分子糖类，造成产酶能力下降，从而SDF提取率下降。因此，确定较佳的发酵时间为72 h。

图6 发酵时间对SDF提取率的影响Fig.6 Effect of fermentation time on the extraction rate of SDF

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 回归模型的建立与分析

综合单因素试验结果，为了优化发酵法制取毛竹笋SDF最大提取率，选取料液比(A)、接种量(B)、发酵时间(C)为自变量，以SDF提取率为指标进行三因素三水平Box-Behnken 响应面试验设计，试验结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 Box-Behnken试验结果Table 3 The results of Box-Behnken test

表4 模型回归方程及方差分析Table 4 The model regression equation and analysis of variance

用Design-Expert软件对表3中数据进行分析，得到3个因素与SDF提取率之间的二次多项回归模型方程为：Y=26.54+0.98A+0.69B+0.41C+0.50AB-0.15AC-0.12BC-2.93A2-1.41B2-1.21C2。

2.2.2 响应面试验方差分析

由表4方差分析可知，模型的P<0.0001，呈现出极显著差异，说明回归模型对毛竹笋SDF提取率具有很好的预测性。模型决定系数R2=0.9805>0.95，模型修正决定系数RAdj2=0.9554，说明回归模型的可信度高，并且与实际试验所得数据拟合情况较好，呈现高度相关性；失拟项的P=0.2079>0.05，不显著，说明模型研究以外的因素对毛竹笋SDF提取率的影响较小。单因素A、B以及平方项A2、B2、C2对SDF提取率的影响极显著(P<0.01)；C影响显著(P<0.05)，而各因素的交互作用影响不显著(P>0.05)。由显著性检验F值、P值的大小得出各因素对毛竹笋SDF提取率影响的顺序为料液比(A)>接种量(B)>发酵时间(C)。综上，可以用该模型回归方程分析和预测毛竹笋SDF制备工艺的结果，具有一定的实用性[22]。

2.2.3 响应面图分析

各因素的交互作用显著情况可根据曲面图进行分析，曲面的倾斜程度与显著性成正相关。响应面图显示了料液比、接种量和发酵时间3个因素之间的交相互作用对SDF提取率的影响，各交互项对毛竹笋SDF提取率的影响见图7。

图7 各因素交互作用对毛竹笋SDF提取率影响的响应面图Fig.7 Response surface diagrams of the influence of the interaction of various factors on the SDF extraction rate of bamboo shoots

由图7中a，b，c的响应面图可知，其他因素固定不变时，该因素条件下制取的SDF提取率均先升高后降低，图在经过中心点处取得最大值，趋势图呈开口向下的抛物线。根据响应面图的陡峭程度可得出料液比对试验结果影响最大，接种量次之，发酵时间最小。固定其中一个量不变，考察另外两个变量的影响情况，曲面倾斜度变化不明显，即交互作用对试验结果无显著影响，这与表4方差分析结果相一致[23]。

2.2.4 最佳工艺条件确定及验证试验

以二次线性回归方程的分析结果为依据，确定毛竹笋SDF的最佳制备工艺条件为：料液比1∶15.74、接种量10.54%、发酵时间75.49 h，毛竹笋SDF提取率为26.75%。结合生产实际的可操作性，确定毛竹笋SDF制备的最优条件为料液比1∶16、接种量10.5%、发酵时间75 h。在此条件下进行验证试验(n=3)，测得毛竹笋SDF提取率为27.23%，与理论预测值接近，无显著性差异(P>0.05),说明回归模型与实际情况呈现较好的拟合度，同时也验证了响应面试验分析毛竹笋SDF提取工艺得到的参数准确可靠，具有一定的实用价值。

2.3 发酵前后毛竹笋SDF超微结构分析

由图8可知，发酵前SDF呈现疏松多孔的空间网状结构，褶皱较多。黑曲霉发酵后，SDF分子结构之间变得蓬松且有序，呈现复杂的空间网状结构，其比表面积相较于发酵之前有很大程度的增大，这可能是因为黑曲霉发酵过程中产生大量的纤维素酶、半纤维素酶分解笋中的纤维多糖，分子链断裂，IDF分解成SDF，分子量降低，聚合度减小，比表面积增大。因此，黑曲霉发酵处理后改变了毛竹笋SDF的表观结构，而表面微观结构的变化可能会对其理化性能产生一定影响[24]。

图8 发酵前后毛竹笋SDF扫描电镜图(5000×)Fig.8 The scanning electron microscope images of bamboo shoots before and after fermentation (5000×)

2.4 发酵前后毛竹笋SDF功能特性的变化

由表5可知，发酵后毛竹笋SDF的理化性能较发酵前均显著提高(P<0.05)，持水力和持油力分别提高了80.06%和62.88%，膨胀力和溶解性分别提高了75.28%和26.50%。毛竹笋经黑曲霉发酵后，DF组分由于糖苷键的断裂使得大分子物质转变为小分子组分，从而使SDF结构变得更为疏松，体积和比表面积增大，亲水基团暴露于表面，使得持水力、持油力、膨胀力提高。黑曲霉发酵后毛竹笋SDF的溶解性达到了7.16 g/g，比发酵前相同条件下(pH 7.0，28 ℃)提高了26.50%。人体小肠(pH 7.0)是胆固醇主要的消化吸收场所[25]，因此在模拟小肠的中性环境(pH 7.0)条件下对发酵前后毛竹笋SDF吸附胆固醇的能力进行比较。结果表明，经黑曲霉发酵后毛竹笋SDF对胆固醇的吸附能力达到1.98 mg/g，比发酵前提高了115.22%，显著高于发酵前的胆固醇吸附能力，可作为功能性食品配料延缓体内摄入过多胆固醇。

表5 发酵前后毛竹笋SDF功能特性的变化Table 5 The changes of functional properties of SDF from bamboo shoots before and after fermentation

3 结论

利用黑曲霉和毛霉发酵毛竹笋，对比其对纤维素酶活力和SDF提取率的影响，确定黑曲霉作为发酵毛竹笋的最佳菌种。通过单因素试验分析和响应面优化，以SDF提取率为指标，确定毛竹笋SDF制取的最优条件为：料液比1∶16、接种量10.5%、发酵时间75 h，在此条件下测得毛竹笋SDF提取率为27.23%，比发酵前提高了20.21%。采用模型回归方程拟合分析及验证试验，证实该模型显著并且具有较高的相关性。扫描电镜结果显示：黑曲霉发酵后毛竹笋SDF呈现复杂的空间网状结构，且蓬松有序，比表面积明显增大。理化特性结果显示：发酵后毛竹笋SDF具有较高的持水力、持油力、膨胀力，具备良好的溶解性能以及吸附胆固醇能力。因此，黑曲霉发酵制取的毛竹笋SDF符合高品质膳食纤维的要求，具有一定的应用前景。