林木病原微生物鉴定及分类方法进展探究

孙 尚

（江西农业大学林学院，江西 南昌 330045）

1.国内外病原微生物研究进展

植物病害会对林业产生一定的危害，例如造成板栗疫病、欧美杨细菌溃疡病、柑橘黄龙病等森林病害，对林业造成重大的经济损失。植物病害常见的有侵染性病害和非侵染性病害，非侵染性病害由非侵染性病害(环境)因素引起的病害；侵染性病害是由生物性病原引起的病害，生物性病害病原可分为真菌性、细菌性、病毒性和螨类等。

传统分类鉴定方法的相关研究一般依照柯赫式法则，通常是先取病叶通过组织分离法获取病原微生物，通过查阅文献资料进行分类鉴定，后通过回接试验引起寄主植物发病，而后将再分离出的微生物与接种微生物比较。这种方法是植物病理学上的经典，沿用至今。如黄泽余等对广西红树林真菌病害区系进行研究，发现病原真菌引起的叶部病害是红树林的主要病害。费显伟等对李树细菌性穿孔病进行病原鉴定，发现病原物为一种革兰氏阴性细菌。

随着现代分子生物学技术的发展，新的技术在病原菌鉴定方面表现出较高的应用价值。如随机扩增多态性DNA技术，制性片段长度多态性(RFLP)技术，实时荧光定量PCR技术的应用，为病原鉴定提供了提供了可靠手段。比如，刘鹏等根据病原菌的核糖体DNA 16 S-23 S区域设计特异性引物，应用16S rDNA PCR定量快速准确地检测到蝴蝶兰软腐病原，该方法较传统的PCR灵敏度高100倍；Guglielmo等利用多重 PCR，针对不同属立木腐朽菌设计特异性引物，共鉴定了11属的立木腐朽菌。

病原微生物的致病性试验作为柯赫式法则的重要一步分，也经历着不断发展。如今，对寄主植物回接的主要方式有穿刺接种法、打孔接种法、喷雾法接种、离体叶片接种法等。通过对寄主植物发病症状和发病程度的观察，可以证明病源微生物的致病性。于磊等成功分离出桉树溃疡病病原菌并在桉树幼苗上得以检验；叶青静等通过苗期喷雾法接种和离体叶片接种法对番茄灰叶斑病原菌进行反接实验，验证了病原菌的致病性。

2.细菌分类研究进程

细菌分类工作主要包括细菌分离，鉴定，描述，命名，保藏。最小的细菌长度仅有0.2nm，由于细菌个体过小，直到17世纪细菌才第一次在显微镜下露出它本来面目。至此人们开始对形态各异的细菌进行分类，而双名法的出现使得细菌的命名得以规范。在1970年的第十届国际微生物学大会上发布的《国际细菌命名法规》，为细菌命名制定了统一的标准。《法规》认为细菌新名称需要在国际系统进化微生物学杂志上发表方可算是合格的发表。

第一个使用双名法并建立细菌分类系统的是Ferdinand Cohn。丹麦科学家orla-jensen和荷兰科学家Kluyver在进行细菌分类研究中引入了细菌生理特征指标，接着，科学家们发现不同细菌的生化性状也具有特异性，如血清反应等，于是生化指标也成为用于细菌分类鉴定的工具。生理生化指标和形态特征共同用于细菌分类鉴定，使细菌分类方法得到完善，并极大的推动了细菌分类工作的发展。由于生理、生化特征指标容易受到某些主观因素的影响，细菌的分类需要引入其他手段。

因此数值分类法应运而生，最早采用此方法的是sneath，将信息技术引入细菌鉴定，开发出新的细菌分类系统—数值分类用于细分类鉴定，如核酸分析，DNADNA杂交，DNA-rRNA杂交等，这些以待测菌株的遗传信息为基础进行分类的指标使得细菌分类更为准确。这些分子手段使得细菌鉴定的途径更加丰富，而产生于1986年的基因组学更是在发掘新基因，揭示非编码功能序列及研究物质进化史等方面发挥着重要作用。

由于微生物基因组比较小，研究起来难度也更小一些，所以基因组的研究最早是从微生物开始的。世界上第一个进行全基因组测序的微生物是流感嗜血杆菌于1995年被测序，模式生物大肠杆菌)的全基因组序列于1997年被测定。而在我国，第一个由我国自主测序得到的全基因组序列是在2002年由北京华大基因研发中心利用WGS的方法测序和组装得到的腾冲嗜热厌氧菌。这比世界上第一株进行全基因组测序的细菌要晚七年，但是近年来随着我国在微生物方面投入加大，我国微生物的科研也得到了快速发展，越来越多的微生物进行了全基因组测序.随着这些微生物完成了全基因组的测序的工作，这也表明我国在微生物基因组领域得到了快速的发展。

随着物理技术研究的深入，气相色谱，液相色谱也开始应用于细菌分类研究中，一些化学分析指标也被运用于细菌分类鉴定中，如急性脂、呼吸醌、脂肪酸的成分及含量，肽聚糖，胞壁酸和细胞壁糖成分分析等。这些跨学科的新方法完善了细菌分类鉴定技术，对于那些使用生理，生化性状无法鉴定的物种有了新的研究方法。

到了现代，细菌分类已经进入了多相分类的发展阶段，综合多种方法对待测菌株的分类地位进行科学研究，从形态特点，生理生化性状再到分子手段，化学成分分析等多个层面对细菌的各种性状分析，建立细菌的多相分类系统，力求合理的展示细菌之间的亲缘关系。

3.真菌分类研究进程

真菌的分类系统依然使用双名法对新物种命名。真菌的传统分类方法主要是以形态和生理化特征为依据，通过对细胞形态、大小、排列、运动性、特殊构造和染色反应及菌落形态以及在培养基中的生长状态，来鉴定该菌株的属种。形态特征是细胞内部基因与外界环境因素共同作用的结果，由于受到环境因子的影响，形态学鉴定结果往往是不准确的。这时分子生物学技术的发展，为真菌分类鉴定开辟了新途径。通过対DNA碱基组成的摩尔百分比例的探究，是早期运用于真菌进行分类鉴定的分子手段。由于该方法只能测定到纲，所以需要其他方法对真菌鉴定进行补充。现如今，核糖体脱氧核酸(rDNA)序列测定、DNA分子杂交技术、线粒体DNA限制性片段多态性(RFLP)分析 ，随机扩增多态性分析(RAPD)技术等方法的应用，使得真菌分类研究变得操作简便、准确和可靠。

4.林木病原微生物鉴定及分类方法展望

自从1665 年列文虎克发明第一个显微镜，使人们来到了微生物的世界。而1882年柯赫氏法则，让人类拥有了与植物病害打交道的手段。在长达百年的发展中，尤其是分子技术的出现，让林木病原微生物鉴定手段越来越丰富。如今，全基因组测序，看家基因分析，多基因序列分析，多重pcr检测技术层出不穷，让微生物分类在分子层面上有了更多的解释方法；而随着电子显微镜的出现，也让很多微观结构成为微生物形态学分类的重要指标。随着工业科技的不断提升，微生物的分类界限也将愈加清晰，森林病原微生物的鉴定手段也更加方便快捷。