15株杜氏藻形态与生理生化特征分析

宋 韡，徐 璐，汤丽群，陈庆彬*

（1.山西体育职业学院，山西太原 030006；2.山西大学生命科学学院，山西太原 030006）

0 引言

杜氏藻（Dunaliella）简称盐藻，属于绿藻门、绿藻纲、杜氏藻科、杜氏藻属[1]，是一类单细胞嗜盐微藻[2]。属于光合自养型生物[3]，可合成叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、β-胡萝卜素等多种色素。

当前，杜氏藻在生物医药、食品加工、生物柴油等领域的商业开发潜力巨大，可生产天然的、产量可观的β-胡萝卜素、甘油、藻多糖、多不饱和脂肪酸、多种活性酶类、维生素等等高附加值产品[4]。此外，杜氏藻还具有固定碳的作用，能够有效地减缓温室效应[5]，因此，杜氏藻也成为生产生物质能的研究热点[6]。然而，目前国内外对于杜氏藻属的研究多仅限于模式藻种或少数常见藻种的形态学鉴定、耐盐机制和系统发育或分类学研究[7]，对于不同来源、不同品系的杜氏藻生理生化特征的研究却很少。本研究对15株杜氏藻株进行5个典型的生理生化指标测定，研究结果将为特色藻株的筛选、功能的开发、特色资源的定向选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 藻种的培养

通过在国内盐水水域采样及国外藻种库的购置，共获得15株杜氏藻，即D.primolecta编号Ds-1（英国，CCAP，藻种库），D.maritima编号Ds-2，D.peircei编号Ds-3，D.viridis编号Ds-4，D.bioculata编号Ds-5，D.quartolecta编号Ds-6，D.parva编号Ds-7，D.salina编号Ds-8，D.polymorpha编号Ds-9，D.tertiolecta编号Ds-10，D.acidophila编号Ds-11，D.bioculata_C33编号Ds-12（美国，UTEX，藻种保藏中心），D.salina_42编号Ds-13美国，UTEX，藻种保藏中心，Dunaliella sp编号Ds-14（英国，CCAP，藻种库），D.apiculata编号Ds-15（美国，UTEX，藻种保藏中心）。将15株杜氏藻用Dunaliella medium（D.m）培养基进行室内扩大培养[8-9]。

1.2 吸光值的测定及细胞形态的观察

利用紫外-可见光分光光度计（TU-1810，北京普析通用有限责任公司，中国）测定686 nm处的吸光值[10]，间隔两天测定一次。

1.3 叶绿素荧光参数的测定

参考Markou和Muylaert[11]对叶绿素荧光参数的测定方法，采用携式PAM叶绿素荧光仪（AquaPen-CAP-C 100，北京易科泰科技有限公司，中国）进行测定。

1.4 叶绿素及类胡萝卜素含量的测定

参考Mera[12]的方法测定665 nm、649 nm、470 nm的吸光值，通过公式可计算出叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素的含量。

1.5 藻多糖的测定

采用苯酚-硫酸法[13-14]测定藻多糖含量，480 nm处测定溶液的吸光值，根据葡萄糖标准曲线公式计算藻多糖浓度。

1.6 β-胡萝卜素含量的测定

在452 nm处测定吸光值。根据β-胡萝卜素标准曲线计算β-胡萝卜素含量[15]。

1.7 牻牛儿基焦磷酸合酶（GGPS）酶活的测定

在450 nm处测定其吸光值，按照GGPS酶活标准曲线测算藻细胞GGPS总酶活和单细胞酶活。

2 结果与分析

2.1 叶绿素荧光参数值测定

15株杜氏藻的Fv/Fo和Fv/Fm数据变化趋势相似，即Fv/Fo和Fv/Fm数值变化曲线均为先增加后降低，D2、D6、D8、D14的Fv/Fo和Fv/Fm在第8天达到最大，D1、D7、D9、D10、D13的Fv/Fo和Fv/Fm在第11天达到最大，D3、D5、D6、D11、D12、D15的Fv/Fo和Fv/Fm在第15天达到最大。这表明15株杜氏藻的光合效率整体变化趋势较为一致，但部分藻株的某个生长期内的光合效率略有差异性。

2.2 叶绿素及类胡萝卜素含量测定

整个生长期内，15株杜氏藻的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的整体变化趋势为逐渐上升。其中，Ds-6和Ds-8的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的累积量最大（叶绿素a含量为16~17 mg/L，叶绿素b含量为9.1~10.2 mg/L，类胡萝卜素含量为6.3~6.4 mg/L），Ds-15的叶绿素a和类胡萝卜素的累积量最小（叶绿素a含量为7.30 mg/L，类胡萝卜素含量为1.881 mg/L）。这表明15株杜氏藻中叶绿素和类胡萝卜素合成含量具有差异性，但整体变化趋势相同，都随时间逐渐积累，其中Ds-6和Ds-8可作为研究杜氏藻中叶绿素和类胡萝卜素代谢机制的供试藻种。

2.3 藻多糖的标准曲线及含量

葡萄糖浓度与480 nm吸光值的标准曲线回归方程为：y=0.0034x-0.0094，相关系数为0.9957。分别测定15株杜氏藻在生长成熟期的藻多糖含量。根据测定结果，Ds-4的胞内多糖含量最高，可选育作为研究藻多糖对抗肿瘤研究的原材料，Ds-15的胞内多糖含量最低。

2.4 β-胡萝卜素的标准曲线及含量

β-胡萝卜素浓度与470 nm吸光值的标准曲线线性回归方程为：y=0.2687x-0.0051，相关系数为0.9945。分别测定处于对数期和成熟期的15株杜氏藻的β-胡萝卜素含量。结果，成熟期的杜氏藻β-胡萝卜素含量高于对数期。对数期时Ds-1的β-胡萝卜素含量最高，为5.13×10-2mg/ml；Ds-13的β-胡萝卜素含量最低，为1.27×10-2mg/ml；成熟期时Ds-4的β-胡萝卜素含量最高为11.37×10-2mg/ml，Ds-15的β-胡萝卜素含量最低为4.3×10-2mg/ml。

2.5 牻牛儿基焦磷酸合酶（GGPS）酶活的测定

D14的GGPS单细胞酶活力最高，表明GGPS基因的表达量较高，适合用来进行杜氏藻GGPS基因的深入研究。

15株杜氏藻的总酶活在对数期均高于成熟期。采用SPSS软件对GGPS总酶活与β-胡萝卜素含量进行逐步回归分析，结果显示：对数期和成熟期的显著性相关值分别为0.981和0.961，表明二者关系为正相关。

3 结语

藻株叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素及β-胡萝卜素含量均随时间而逐渐累积，其叶绿素荧光参数变化均为先上升后下降。15株杜氏藻中筛选获得的Ds-1，其β-胡萝卜素含量最高，可用于工业生产β-胡萝卜素；筛选获得的Ds-4成熟期多糖含量最高，可用于杜氏藻多糖对的生物医药研究；Ds-14中GGPS酶活力最强，可用于杜氏藻类胡萝卜素代谢机制的研究。尽管15株杜氏藻胞内GGPS酶活随时期的增长而降低，但其总酶活与β-胡萝卜素含量呈正相关，推测杜氏藻胞内除GGPS外，其β-胡萝卜素的合成代谢还受其它多种酶类，如GGPP合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、ζ-胡萝卜素脱氢酶、类胡萝卜素异构酶、15-顺式-ζ-异构酶、番茄红素β-环化酶的协同调控。本研究深入分析了不同类型杜氏藻株的生理和生化特征，筛选获得了特色的杜氏藻资源，研究结果将为该类藻资源的功能开发与利用奠定理论基础。