探讨高效液相色谱法测定海水鱼中嘌呤含量

严玮桐

（九江市检验检测认证中心食品分中心，江西九江 332000）

1 材料与方法

1.1 原料

本次试验所用的海水鱼，选择新鲜的海鲈鱼、黄花鱼、鳕鱼3种鱼类，均购置某水产市场。

1.2 仪器和试剂

电子天平、HPLC仪、pH计、紫外-可见分光光度计、超声清洗器、冷冻高速离心机、真空旋转蒸发仪、绞肉机、电热恒温水槽和超纯水系统等。

色谱级的腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤，纯度均＞99%；色谱纯甲醇、四丁基氢氧化铵、冰乙酸、三氟乙酸；分析纯甲酸、高氯酸等。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

（1）流动相。参考曲欣[1]的研究，色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；流动相：水-甲醇-冰乙酸-20%四丁基氢氧化铵，体积比：879∶100∶15∶6；柱温：30 ℃，流速：1 mL/min，进样量：10 μL，检测波长：254 nm。在此基础上进行优化，确定最佳流速和检测波长。

（2）流速。流动相确定后，选择3种流速分离嘌呤， 分 别 是 0.8 mL/min、1 mL/min、1.2 mL/min，对比确定最佳流速。结果显示：这3种流速均能在10 min内完成嘌呤的分离，其中0.8 mL/min分离效果最好，峰型最明显，因此确定最佳流速是0.8 mL/min。

（3）检测波长。配置嘌呤溶液，浓度为10 mg/L，然后进行全光谱扫描，设置范围在200～400 nm，从而确定适宜检测波长。结果显示：嘌呤溶液在200～300 nm有吸收峰，腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤的最大吸收波长分别是265 nm、271 nm、254 nm、278 nm。INAZAWA[2]的研究中，波长选择为260 nm；其他学者的研究中有254 nm、255 nm等[3-4]。本次试验分析，发现几种波长的检测结果没有明显差异，最终选择254 nm为检测波长。

经过优化，最终确定色谱条件：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色 谱 柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；流动相是水-甲醇-冰乙酸-20%四丁基氢氧化铵，体积比为879∶100∶15∶6；柱温30 ℃，流速为0.8 mL/min，检测波长为254 nm，进样量为 10 μL。

1.3.2 样品处理

对海水鱼样品进行处理，目前已知方法有超声法、高氯酸法、混合酸法等。其中，超声法虽然操作简单，但嘌呤的提取率低。高氯酸法操作步骤复杂，等待时间长，容易生成氯气，会危害人身健康。混合酸法不仅对嘌呤的提取率高，而且甲酸对嘌呤具有保护作用。本研究最终采用混合酸法进行样品处理，混合酸的组成是：三氟乙酸和甲酸，两者的体积比是1∶1。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

配制单一标准储备液，浓度为1 600 mg/L，置于冰箱内在4 ℃恒温下保存。取等体积4种嘌呤的单一标准储备液，配制混合标准储备液，浓度为4 00 mg/L。然后加入超纯水稀释处理，配制出不同浓度的溶液，分别是200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L 和 0.1 mg/L。这些溶液使用0.45 μm的微孔滤膜过滤，然后进行色谱分析，检出限是3倍信噪比对应的浓度。

根据优化后的色谱条件，检测混合标品中的嘌呤含量。以样品浓度作为X轴，以峰面积作为Y轴，进行线性回归分析，得出回归方程，并计算相关系数R，见表1。结果显示，这4种嘌呤在0.1～400 mg/L的浓度范围内，具有良好的线性关系，相关系数≥0.998，检出限在0.047～0.106 mg/L。

表1 线性回归分析结果

2.2 精密度

采用优化后的色谱条件，对300 mg/L的混合标品连续进样6次，根据每一次的测定结果，计算相对标准偏差（RSD），见表2。结果显示，6次进样测定值的RSD在0.021%～0.689，说明该方法的精度较高。

表2 精密度试验结果

2.3 加标回收率

使用电子天平准确称量海鲈鱼的鱼肉样品2.4 g，平均分为12份，每份样品0.2 g。采用混合酸法进行处理，并根据优化后的色谱条件进行检测。按照嘌呤含量的0.5倍、1.2倍，分别加入嘌呤标准品，配制成不同浓度的样品，每个样品测定3次，计算回收率和RSD值，见表3。结果显示，4种嘌呤的平均回收率在94.289%～102.919%，说明该方法处理样品能减少嘌呤的损失量。

表3 加标回收率试验结果

2.4 嘌呤含量测定结果

对3种海水鱼样品，分别选择鱼肉、鱼皮和内脏3个部位，按照1.3.2方法进行处理，采用优化后的色谱条件进行检测，得到4种嘌呤含量，并计算总嘌呤含量，见表4。分析可知：①不同海水鱼中的嘌呤含量差异明显，海鲈鱼的次黄嘌呤和黄嘌呤含量最高，黄花鱼的腺嘌呤含量最高，鳕鱼的鸟嘌呤含量最高，总嘌呤含量海鲈鱼＞鳕鱼＞黄花鱼；②同一海水鱼中，不同部位的嘌呤含量差异明显，内脏中的腺嘌呤和黄嘌呤含量最高，鱼皮中的鸟嘌呤含量最高，鱼肉中的次黄嘌呤含量最高，总体上鱼皮＞内脏＞鱼肉。

表4 海水鱼中4种嘌呤的含量测定结果（单位：mg/kg）

3 结论

HPLC技术具有高压、高速、高灵敏度、进样量少和环保的特点[5]。本次研究针对海鲈鱼、黄花鱼、鳕鱼3种海水鱼类，建立HPLC检测方案，优化色谱条件后测定样品不同部位的腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤含量，结论如下。

（1）选用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；以水-甲醇-冰乙酸-20%四丁基氢氧化铵为流动相，体积比为879∶100∶15∶6；柱温30 ℃，流速为0.8 mL/min，检测波长为254 nm。经试验证实，4种嘌呤在0.1～400 mg/L的浓度范围内，具有良好的线性关系，精密度较高，回收率良好。

（2）总嘌呤含量方面：海鲈鱼＞鳕鱼＞黄花鱼；不同部位方面：鱼皮＞内脏＞鱼肉。为避免人体内嘌呤含量增高，预防高尿酸血症和痛风，提示人们少食用海鲈鱼，合理食用鳕鱼、黄花鱼；优先食用鱼肉，减少鱼皮和内脏的摄入量。