大鲵胶原蛋白肽制备工艺的优化

于 洋，王东方，王 欣，白义化，邢晓明，冯 静

（威海市宇王集团海洋生物工程有限公司，山东威海 264200）

大鲵又称娃娃鱼，是世界上现存两栖类动物中寿命最长的动物。野生大鲵作为我国珍稀名贵特产，已被列为国家二级保护动物[1-2]，经现代营养成分分析研究结果表明：其含有18种氨基酸，是人体营养需求的优质蛋白源，具有极高的营养价值和药用价值，被誉为“水中人参”[3]。大鲵喜栖息于山区清澈溪流以及山溪的石隙间，洞穴位于水面以下。其是中国特有物种，产于华北华中、华南和西南各省。近年来，由于人为因素，尤其是生存环境丧失、栖息地破坏以及过度利用，使野生大鲵物种数量锐减，大鲵的分布区成倍缩小。其生存地点多为人们难以达到的石灰岩溶洞或者地下暗河。溶洞或者暗河这些恶劣的环境下，大鲵生存受到严峻的胁迫。现因国家批准许可小部分养殖专业户利用人工养殖子二代以下的个体进行科研、加工和利用，故涌现大量人工养殖和驯化大鲵的景象。目前，大鲵主要被粗加工成菜肴，但大鲵的深加工产品寥寥无几。所以为了充分有效地开发利用人工养殖子二代大鲵和提高其附加值，其营养价值等问题的研究非常重要。

胶原蛋白广泛存在于自然界的动物组织中，并且具有重要的作用。因其结构的多样性和良好的生物相容性，在日常生活中，胶原蛋白被广泛地应用于食品、化妆品、生物医学等领域，而它的生产来源主要依赖于陆地生物（主要为猪和牛）。由于氨基酸组成和交联度等方面的差异，使得大鲵所含有的丰富胶原蛋白具有很多牲畜胶原蛋白所没有的优点，例如大鲵胶原蛋白肽具有胶原蛋白含量高、分子量低、生物污染物少和毒素微量、低抗原性、低过敏性等优点。传统大鲵胶原蛋白肽提取工艺是先将大鲵经过高温提取，在最适pH条件下，加入适量的酶解剂，进行酶解提取，即成肽，完成后进行精细过滤；滤液进入蒸发浓缩系统浓缩脱水，经浓缩后的液体达到一定浓度后，进入喷雾干燥设备，所得粉末即为大鲵胶原蛋白肽。但是这样制得的传统大鲵胶原蛋白肽，过滤传统工艺有以下缺点：①提取液体积较大，产品的生产周期较长；②酶解液除杂不彻底，影响产品品质；③所得成品往往具有苦腥味，口感差。基于此，本文以人工养殖子二代大鲵为原料，对大鲵胶原蛋白肽的工艺进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大鲵，威海市宇王集团海洋生物工程有限公司提供；水解蛋白酶（40万U/g）、中性蛋白酶（20万U/g）、风味蛋白酶（10万U/g），诺维信（中国）生物技术有限公司。

胶原蛋白肽生产线，威海市宇王集团海洋生物工程有限公司；生物膜过滤系统，合肥科佳高分子材料科技有限公司；高效液相色谱仪，日本岛津公司；恒温干燥箱，上海琅玕实验设备有限公司；超声水浴箱，昆山美美超声仪器有限公司；超声波振荡器，昆山美美超声仪器有限公司；分析天平，奥豪斯仪器常州有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 大鲵胶原蛋白肽制备工艺的优化

本研究在前期研究的基础上，针对大鲵胶原蛋白肽质量不高、纯度低、异味重、过敏原难去除以及分子量分布不均等许多共性问题和难题，精确研究分子量均一可控的酶解关键技术，以及生物膜过滤纯化核心配套技术，实现规模化生产高纯度、高效率、低能耗、分子量均一可控的大鲵胶原蛋白肽产品自主创新技术。大鲵胶原蛋白肽提取优化工艺为人工养殖子二代大鲵→宰杀去胆囊和脂肪组织→预处理→脱脂→绞碎→提取→酶解催化→脱腥脱味→多级生物膜过滤分离技术→浓缩→喷雾干燥。

1.2.2 试验步骤

①样品处理：将活的人工养殖子二代大鲵停食数天使其排空肠道，再宰杀，去胆囊和部分脂肪组织。②预处理：将大鲵清洗干净，并切成1～3 cm大鲵块，备用。③脱脂：用氢氧化钠溶液对大鲵块进行脱脂处理，脱脂温度为20～25 ℃，时间1 h。④绞碎：将脱脂后的大鲵块投入绞肉机中，绞成肉糜。⑤提取：将脱脂处理后的大鲵块加水提取，提取过程中控制温度95～100 ℃，熬煮时间1 h。⑥酶解催化：待提取液冷却后，加入水解蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶组成的复合蛋白酶进行酶解。酶解温度为50～55 ℃，酶解时的pH控制在7.5～8.5左右，酶解时间4 h。⑦灭活：酶解完成后将酶解液升温灭活，灭火温度为90～100 ℃，灭火时间20～30 min。⑧脱腥脱味：将酶解液经过多级过滤后，加入活性炭和助滤剂进行脱炭处理30 min，得到澄清透亮的大鲵酶解液。⑨多级生物膜过滤分离技术：在常温下对物料进行有效的过滤，分离时不发生相变化，适用对胶原蛋白肽进行分离，去除杂质、菌丝。对于大鲵酶解液中分子量为150～1 000 Dalton小分子肽有分离性能；对于无机盐的分离则存在Donnan效应。⑩浓缩：利用双效浓缩器对大鲵胶原蛋白肽液进行浓缩。⑪离心喷雾：离心喷雾干燥得到大鲵胶原蛋白肽粉。

2 结果与分析

工艺改进前后生产的大鲵胶原蛋白肽的分子量如图1、图2所示。传统工艺生产的大鲵胶原蛋白肽相对分子量小于1 000 D的水解物所占比例为36.2%；而水解物中≥80%的肽段相对分子质量为643.7，如表1所示。工艺改进后生产的大鲵胶原蛋白肽中相对分子量＜1 000 D的肽段占比达到95.04%，≥80%肽段的相对分子质量为317.14，如表2所示。因此，通过多级逆流萃取技术和纳滤膜分离技术的共同改进，生产出的大鲵胶原蛋白肽粉的分子量由原来的1 000 D～2 000 D变成现在均一稳定、易于人体吸收且低于1 000 D的低聚肽。高温催化、风味酶的添加、管膜、纳滤膜过滤等方法避免了胶原蛋白肽在酶解过程中产生的苦味肽，使得现在生产的大鲵胶原蛋白肽的口感更优，并且无明显的腥苦味，为以后以大鲵胶原蛋白肽为基础生产不同剂型的保健品、饮品、糖果等提供了保障，可满足不同客户人群的需求。

图1 传统工艺生产大鲵胶原蛋白肽的分子量分布图

图2 工艺改进后生产大鲵胶原蛋白肽的分子量分布图

表1 传统工艺生产大鲵胶原蛋白肽分子量分布范围

表2 工艺改进后生产大鲵胶原蛋白肽分子量分布范围

3 结论

本研究采用碱处理对大鲵进行脱脂预处理，通过三重生物酶复合酶解和多级逆流固液萃取技术以及生物滤膜过滤技术，将原来分子量大部分为1 000～2 000 D的大鲵胶原蛋白肽更新为分子量在1 000 D以下的低分子量的产品，获得了高纯度、无异味、易于人体吸收的低分子量的大鲵胶原蛋白肽，为不同人群、不同需求供应不同产品提供了技术支持。并且有文献记载，小分子量多肽更有利于人体吸收和抗氧化活性的增强［4-5］，这表明大鲵活性肽作为保健食品具有潜在的优势。

经过提取工艺的改进和采用多级生物膜过滤分离技术，大鲵胶原蛋白肽的分子量由原来小于1 000 D的蛋白质水解物所占比例为36.2%转变为现在95.04%。解决了大鲵胶原蛋白肽产品质量不高、纯度低、异味重、过敏原难去除以及分子量分布不均等许多共性问题和难题，实现了规模化生产高纯度、高效率、低能耗、分子量均一可控的大鲵胶原蛋白肽产品自主创新技术。