CdCl2胁迫对甘蔗幼苗根系细胞壁Cd积累的影响

肖京林，覃 美，杨 曙，易 科，黎晓峰，唐新莲，凌桂芝

(1.广西甘蔗生物学重点实验室/教育部蔗糖产业协同创新中心/广西大学农学院，广西 南宁 530004；2.广西大学农牧产业发展研究院，广西 南宁 530004)

【研究意义】土壤重金属污染是全球面临的重大环境污染之一，镉(Cd)是我国土壤中的主要污染元素[1]。Cd污染会造成植物叶片失绿发黄、植株矮化[2]，抑制根系伸长，引起根系萎烂发黑，甚至导致植物死亡[3]，Cd还会通过食物链影响人体健康[4]。甘蔗是我国重要的热带作物，也是广西地区第一大战略性经济作物[5]，对Cd具有较强的生理耐性，能在Cd污染地区种植，但生产上甘蔗幼苗常出现Cd毒害导致的黄化甚至枯死现象，最终导致甘蔗产量降低，而有关Cd对甘蔗生长影响的研究多集中在甘蔗伸长期和成熟期的Cd吸收、转运和积累特点等方面[6]，对易发生Cd毒害的甘蔗幼苗在CdCl2胁迫下的Cd吸收积累、分配及细胞壁固定Cd的解毒机制等并未深入探讨。因此，探究CdCl2胁迫下甘蔗幼苗根系细胞壁的Cd积累特点及Cd耐性机制，对在土壤Cd超标区域推广种植甘蔗新品种具有重要意义。【前人研究进展】Wang等[7]研究认为，当土壤Cd浓度达233.00 mg/kg时甘蔗产量仅相对降低13.6%，因此，甘蔗在Cd污染土壤上种植潜力较大。刀静梅等[8]研究甘蔗Cd积累特征发现，Cd在甘蔗地下部富集量较大，在地上部富集量较小，转运系数均小于1.000。曾巧英等[9]研究表明，耐Cd甘蔗品种能保持较高生长量的原因可能是通过降低Cd向地上部分转移，使更多Cd积累在根系从而缓解Cd毒害。根系是植物最初接触Cd的部位，其细胞壁中的多糖组分因含带负电荷的羧基、羟基和氨基等基团而具有重金属阳离子结合能力[10]，减少进入细胞的重金属量，使植物表现对Cd胁迫具有耐受性[11]。朱秀红等[12]研究发现，油菜根部和叶部细胞壁Cd所占比例随着Cd胁迫浓度的增加而增加。刘仲齐等[13]研究认为，水稻能够将大量的Cd固定在营养体的细胞壁中，只有极少数的Cd运输到穗轴，从而缓解Cd毒害。张虹等[14]利用FTIR分析小飞蓬根和叶细胞壁上Cd 吸附位点的官能团，发现在小飞蓬根和叶细胞壁吸附Cd的过程中，羟基、羧基和氨基都是Cd的主要结合位点，而果胶主要提供羟基官能团与Cd相结合。进一步研究发现，果胶的甲酯化程度影响其对Cd的结合，如Colzi等[15]研究显示，亚麻下胚轴细胞壁中低甲酯化的果胶是Cd的主要结合位，甲酯化程度越低的果胶结合Cd能力越强。郭军康等[16]对不同年限设施菜地番茄细胞壁果胶Cd累积的研究发现，茎和叶片中果胶含量及果胶甲酯酶(PME)活性与细胞壁Cd累积量呈正相关。可见，Cd胁迫植物时其细胞壁能通过吸附固定Cd而减少Cd向胞内运输，提高植株对Cd的耐受性。【本研究切入点】目前，针对甘蔗幼苗Cd积累、分布和Cd解毒机制的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以新培育的两个高产甘蔗品种中蔗1号和中蔗6号为试验材料开展CdCl2胁迫水培试验，探究其幼苗中Cd的分布特点及其根系细胞壁在CdCl2胁迫下的解毒机制，为高产甘蔗新品种在Cd污染土壤上推广种植提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

中蔗1号(Z1)和中蔗6号(Z6)是由广西大学培育提供、具有适应性强、生长量大和高产等特点的甘蔗新品种，参照武欣等[17]的方法在温室中育苗和培育。胁迫所用Cd为CdCl2，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 CdCl2胁迫对甘蔗幼苗根系、叶片和根系细胞壁Cd含量及细胞壁多糖组分的影响 选取15 d日龄、1心4叶的Z1幼苗分别置于含0(对照)、1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2溶液中培养4 d后，以0.5 mmol/L CaCl2溶液浸泡根系30 min，洗脱附着在根系表面的Cd。Z1幼苗经去离子水清洗根系后，采集根系和叶片，分别测定其Cd含量；称取5.0 g鲜样根系，提取细胞壁后全部烘干并称重，测定鲜样根系和烘干根系细胞壁的Cd含量，计算根系中的Cd和细胞壁中的Cd积累量及根系中细胞壁Cd的积累量占比；提取根系细胞壁烘干并分离细胞壁的果胶和半纤维组分[半纤维素I(HCI)和半纤维素II(HCII)]，测定果胶和半纤维素含量及果胶甲脂化程度，计算去甲酯化果胶含量并测定Cd含量。剪取1.0 cm根尖，用于PME活性(nmol H+/min)测定。3次重复。

1.2.2 CdCl2胁迫对甘蔗种茎初生根相对伸长率和根系活力的影响 选取3 d日龄、初生根长势均匀的Z1和Z6种茎，分别置于含0(对照)、1.0、2.0、5.0 μmol/L(低浓度)和10.0、20.0、50.0、100.0 μmol/L(高浓度)CaCl2溶液中培养。每个种茎为1个重复，设12个重复。培养0和24 h后利用直尺分别量取根长，计算根的相对伸长率；剪取1.0 cm根尖，用氯化三苯四唑(TTC)还原量法测定低浓度CdCl2胁迫下的根系活力，计算TTC还原量[μg/(kg·h)]代表根系活力。

1.2.3 CdCl2胁迫对甘蔗幼苗Cd吸收和积累的影响 选取15 d日龄Z1和Z6幼苗分别置于含0(对照)、1.0、2.0和5.0 μmol/L CaCl2溶液中培养，4 d后以0.5 mmol/L CaCl2溶液浸泡幼苗根系30 min，洗脱附着在根系表面的Cd并采集幼苗根系、叶片和叶鞘，擦拭水分后称量各部分重量，测定各部分的Cd含量，计算地上部(叶片和叶鞘)和地下部(根系)的Cd含量并计算其比值。3次重复。地上部Cd含量=(叶片Cd含量×叶片重量+叶鞘Cd含量×叶鞘重量)/(叶片重量+叶鞘重量)。

选取3 d日龄、初生根长势均匀的Z1和Z6种茎，分别置于含0(对照)、1.0、2.0和5.0 μmol/L CaCl2溶液中培养4 d后，剪取1.0 cm根尖，测定Cd含量。剪取根尖提取细胞壁，并分离根尖细胞壁的果胶和半纤维组分，测定其Cd含量。

上述Cd培养液的pH均为5.5，采用通气泵通气补氧，每1 h通气15 min。

1.3 测定指标及方法

根系活力参照张志勇等[18]的TTC还原量法(方法一中的热提法)进行测定；细胞壁及其多糖组分的提取和分离、果胶甲酯酶活性、果胶甲酯化程度及细胞汁液和残渣的分离均参照Yang等[19]的方法进行操作或测定；Cd含量参照GB 5009.15—2014《食品安全国家标准食品中Cd的测定》[20]的方法进行测定。

根的相对伸长率(%)=不同浓度Cd处理24 h后的根长/对照24 h后的根长×100

Cd处理24 h后的根长=Cd处理24 h后测量的根长-Cd处理0 h测量的根长

1.4 统计分析

试验数据采用Excel 2016进行整理，以Duncan’s新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 甘蔗幼苗的Cd积累特征

从表1可看出，1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2处理15 d日龄幼苗4 d后，其叶片的Cd含量分别为0.79、1.09和1.25 mg/kgFW，均显著高于对照(P<0.05，下同)，根系的Cd含量分别为107.20、134.90和145.20 mg/kgFW，显著高于对照，分别约为叶片Cd含量的136、124和116倍。可见，甘蔗幼苗根系对进入其体内的Cd具有很强的截留能力。

CdCl2处理15 d日龄Z1幼苗4 d后，随着胁迫浓度的提高，其根系细胞壁的Cd在根系中占比也显著增加，1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2处理幼苗根系细胞壁的Cd占比分别为35.80%、44.10%和57.50%。可见，随着CdCl2胁迫浓度的提高，更多的Cd被根系细胞壁所固定积累。

1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2处理15 d日龄Z1幼苗4 d后，其根系细胞壁中的Cd均有95.00%以上累积在果胶和半纤维素组分中。其中，半纤维素组分中的Cd含量占比随着CdCl2浓度的提高而显著降低，但CdCl2浓度为5.0 μmol/L时半纤维素组分中的Cd含量占比仍达60.27%，而果胶组分中的Cd含量占比(分别为18.71%、28.52%和36.28%)随着CdCl2浓度的提高而显著升高。可见，甘蔗根系细胞壁中的果胶和半纤维素均为积累Cd的主要组分，且随着CdCl2胁迫浓度的提高，果胶中的Cd含量占比显著增加。

2.2 CdCl2胁迫对甘蔗幼苗根系细胞壁及其多糖组分的影响

为了解甘蔗幼苗根系细胞壁固定Cd的机制，需对CdCl2胁迫1心4叶甘蔗幼苗4 d后的根系细胞壁果胶和半纤维素含量、果胶PME活性和果胶甲酯化程度进行分析。由表2可知，1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2处理Z1幼苗根系细胞壁的半纤维素I(HCI)和半纤维素II(HCII)含量间无显著差异，但其果胶含量和PME活性均显著高于对照，果胶的甲酯化程度均显著低于对照，而去甲酯化果胶含量均显著高于对照。可见，CdCl2胁迫下Z1幼苗根系细胞壁中的果胶组分含量增加及PME催化的果胶甲酯化程度降低，导致Cd在果胶中积累增加，根系细胞壁对Cd的积累量相应增加，减少了Cd向胞内运输，最终使得更多的Cd被截留在根系中从而减少向地上部转运。

表1 CdCl2胁迫对Z1幼苗Cd含量的影响

表2 Cd对甘蔗根系细胞壁组分含量及果胶PME活性、去甲酯化程度和去甲酯化果胶含量的影响

2.3 CdCl2胁迫对蔗种初生根相对伸长率和根系活力的影响

从图1-A可看出，CdCl2处理24 h后，Z1和Z6种茎的初生根伸长率均随着胁迫浓度的提高而显著下降，1.0、2.0和5.0 μmol/L低浓度CdCl2处理种茎初生根的伸长率分别为对照的90.7%和85.1%、87.2%和77.16%及67.6%和64.7%，其中，5.0 μmol/L CdCl2处理种茎初生根的伸长受抑制程度最重；Z1和Z6种茎初生根的相对伸长率间无显著差异(P>0.05，下同)，说明Z1和Z6种茎的初生根对低浓度CdCl2的耐受性相似。10.0、20.0、50.0 μmol/L高浓度CdCl2处理种茎初生根的伸长率分别为对照的41.1%和43.7%、33.6%和30.8%及19.2%和18.1%，且差异显著，而50.0和100.0 μmol/L CdCl2处理种茎的初生根伸长率差异不显著，但二者均显著低于10.0和20.0 μmol/L CdCl2处理。可见，不同浓度CdCl2胁迫均显著抑制甘蔗种茎根的伸长，其中，低CdCl2浓度中的5.0 μmol/L胁迫时根伸长的受抑制程度最高重，高CdCl2浓度中的50.0 μmol/L胁迫时根系几乎已停止伸长。

从图1-B可看出，低浓度CdCl2处理24 h后，Z1和Z6种茎初生根的根尖活力均随着胁迫浓度的提高而下降，1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2处理种茎初生根的根尖活力分别为对照的83.5%和86.1%、77.5%和80.0%及42.4%和42.7%。其中，5.0 μmol/L CdCl2处理Z1和Z6种茎的根尖活力仅分别为283.3和279.6 μg/(kg·h)，且均显著低于对照及1.0和2.0 μmol/L CdCl2处理。可见，低浓度CdCl2胁迫可显著抑制甘蔗种茎的根尖活力。

在同一小图中，图柱上不同小写字母表示差异显著(P<0.05)In the same small graph，different lowercase letters on the bar represented significant difference(P<0.05)图1 不同浓度CdCl2胁迫对甘蔗种茎初生根相对伸长率(A)和根系活力(B)的影响Fig.1 Effects of different concentrations of CdCl2 stress on relative elongation of primary root(A) and root activity of sugarcane seed stems(B)

表3 CdCl2胁迫下的甘蔗幼苗Cd含量比较

综上所述，甘蔗种茎的初生根对CdCl2胁迫十分敏感，低浓度的CdCl2胁迫即可显著抑制其伸长和降低其根尖活力。

2.4 CdCl2胁迫对甘蔗幼苗Cd吸收和积累的影响

由表3可知，2.0和5.0 μmol/L CdCl2处理Z1根系的Cd含量分别为135.20和145.40 mg/kgFW，叶片的Cd含量分别为1.12和1.54 mg/kgFW，叶鞘的Cd含量分别为1.79和3.48 mg/kg FW，均显著高于Z6。可见，CdCl2胁迫下Z1植株较Z6更容易累积Cd。

分析地下部Cd含量与地上部Cd含量的比值可反映植株体内Cd向地上部转运的差异。从表3可看出，2.0和5.0 μmol/L CdCl2处理Z1和Z6幼苗地下部Cd含量与地上部Cd含量的比值均相近，相互间无显著差异，而5.0 μmol/L CdCl2处理Z1和Z6幼苗地下部与地上部Cd含量的比值均显著小于2.0 μmol/L CdCl2处理。可见，虽然Z1和Z6幼苗根系和叶片的Cd含量存在显著差异，但其体内Cd向地上部转运并无显著差异，因此甘蔗幼苗吸收Cd的差异不是由Cd向地上部运输的差异所致。

从表4可看出，不同浓度CdCl2处理3 d日龄Z1和Z6种茎4 d后，其根尖的Cd含量随着CdCl2胁迫浓度的提高而升高，且1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2处理Z1种茎根尖的Cd含量均显著高于Z6；种茎根尖细胞壁的Cd含量和果胶中Cd的积累量均随着CdCl2胁迫浓度的提高而升高，但1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2处理Z1和Z6种茎根尖细胞壁的Cd含量间和果胶中Cd的积累量间均无显著差异。可见，在CdCl2胁迫下Z1种茎根尖中的Cd含量与Z6存在显著差异，但该差异不是细胞壁对Cd的结合能力不同所导致。

3 讨 论

Cd不是植物生长的必需营养元素，Cd胁迫会直接影响植物根系生长，对植物产生毒害效应[21]。大量研究表明，植物根系对Cd胁迫十分敏感，Cd胁迫会抑制水稻根系生长，低浓度的Cd即可致使水稻根系生物量下降22.95%[22]；Cd胁迫会抑制烟草根系伸长和侧根萌发，并使根尖细胞老化死亡[23]。本研究中，甘蔗种茎的初生根对CdCl2胁迫十分敏感，低浓度(1.0～5.0 μmol/L)CdCl2胁迫仅处理1 d即可显著抑制Z1和Z6幼苗根的伸长，其中CdCl2浓度为5.0 μmol/L时根的伸长受抑制程度最重；低浓度(1.0～5.0 μmol/L)CdCl2胁迫也会显著抑制甘蔗种茎的根尖活力；Z1幼苗的Cd含量显著高于Z6。因此推测，Z1对其体内Cd毒害的忍耐能力较强，Z1相对于Z6更适合在Cd污染地区推广种植。

细胞壁是植物体内积累Cd的主要部位[24]。董萌等[25]研究表明，蒌蒿根系吸收的Cd有59%被细胞壁所固定，从而减少向细胞内运输，减轻毒害作用。本研究发现，1.0 μmol/L CdCl2胁迫时，甘蔗幼苗根系中35.80%的Cd积累在细胞壁组分中，随着CdCl2处理浓度的提高根系细胞壁中的Cd含量占比增加，CdCl2胁迫浓度为5.0 μmol/L时根系中的Cd有57.50%被细胞壁所吸附积累。因此推测，CdCl2胁迫下甘蔗幼苗根系细胞壁通过吸附和固定大量的Cd从而减少Cd向胞内运输，使得更多的Cd被截留在根系中，减少向地上部转运，可缓解Cd对甘蔗幼苗的毒害程度。

表4 甘蔗种茎根尖及其细胞壁果胶中Cd的积累量比较

果胶和半纤维素是细胞壁上Cd的主要结合位点。在本研究中，甘蔗幼苗根系细胞壁中有超过60.00%的Cd位于半纤维素组分中，与雷丽萍等[26]研究发现植物中的Cd主要结合在半纤维素上的结果相似。本研究还发现，1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2处理后，甘蔗幼苗根系细胞壁中的Cd仅18.71%～36.28%结合在果胶上，随着CdCl2胁迫浓度的提高，Cd在果胶中的积累量显著升高，说明果胶对抵御Cd进入细胞也具有重要作用；在CdCl2胁迫下，根系细胞壁果胶的PME活性提高，果胶的甲酯化程度降低，并促进果胶组分含量增加，增加果胶对Cd的积累量，提高根系细胞壁对Cd的结合能力，最终使得根系的Cd积累增加，与代晶晶[27]对油菜、徐劼和保积庆[28]对芹菜、Colzi等[29]对石竹的研究结果相似。可见，植物细胞壁中果胶的积累及其去甲酯化修饰可能有利于增加甘蔗细胞壁对Cd的结合能力。

4 结 论

在CdCl2胁迫下，甘蔗幼苗根系的细胞壁是Cd积累的主要部位；CdCl2胁迫会使甘蔗根系细胞壁果胶组分含量增加，PME活性升高，果胶甲酯化程度降低，细胞壁对Cd的结合能力提高，使得更多的Cd被根系细胞壁所固定，从而减少Cd向胞内运输和地上部转运。