温度对黑豆皮活性成分、抗氧化和抗肿瘤活性的影响

胡懿化，鲁静武，何嘉琦，王星滟，张武霞*，李 鹏，张永坡，高春艳，岳爱琴，杜维俊，赵晋忠*

(1.山西农业大学基础部，山西 太谷 030801；2.山西农业大学农学院，山西 太谷 030801)

随着人们生活质量的提高、保健意识的增强，保健食品受到人们青睐。如大蒜具有极好的抗菌效果，能够预防血管老化、增强机体免疫力、预防感冒[1]；胡萝卜、洋葱等具有预防和治疗夜盲症、降糖降脂的作用[2-3]；植物大豆含有丰富的蛋白质、多种氨基酸及微量元素，能够增强人体的免疫功能和记忆力[4]。黑豆是一种药食同源的豆科植物，我国约有2 980份种质资源，其中青仁黑豆的药用价值最高，具有抗氧化、降血脂、降血压、改善贫血、预防癌症、预防肥胖、抗肿瘤等功效[5]。Mu等[6]从黑豆皮中获得的提取物能够明显提高机体血液中铁含量，促进机体造血功能，改善贫血；洪迪清等[7]发现黑豆中的三羟基异黄酮能够有效抑制肺癌、肝癌、结肠癌、食道癌等癌症的发生，也可预防和治疗高血压、脑血栓，维护心脏功能。因此，开发利用黑豆资源具有重要意义。

作者在不同温度下浸提黑豆皮，对黑豆皮提取物中的总黄酮、总酚、花青素、碳水化合物、蛋白质和糖醛酸等6种活性成分进行分析，同时探究其抗氧化活性及抗肿瘤活性，以期为黑豆皮资源的商品化开发奠定理论基础。

1 实验

1.1 材料与试剂

太谷青仁黑豆1号，产于山西太谷县；人胃腺癌细胞株(BGC-823)、宫颈癌细胞株(HeLa)、人大细胞肺癌细胞株(NCI-H460)，自行保存；细胞培养基(RPMI-1640，DMEM)，美国HyClone公司。

噻唑蓝(MTT)、芦丁标准品、没食子酸标准品、葡萄糖标准品、牛血清蛋白标准品、半乳糖醛酸标准品，北京索莱宝生物科技有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶，四季青生物公司。

1.2 方法

1.2.1 黑豆皮提取物的制备

收集高品质黑豆皮，净水清洗3遍，80 ℃不断翻搅下烘焙40 min；称取适量干黑豆皮4份，分别用70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃的蒸馏水浸提30 min，过滤，滤液浓缩、冻干，即得黑豆皮提取物。

1.2.2 黑豆皮提取物中6种活性成分的测定

以芦丁为标准品，采用Al(NO3)3络合分光光度法测定黑豆皮提取物中总黄酮的含量[8]；以没食子酸为标准品，采用福林酚法测定黑豆皮提取物中总酚的含量[9]；参照pH示差法测定黑豆皮提取物中花青素的含量[10]；以葡萄糖为标准品，采用硫酸-苯酚法测定黑豆皮提取物中碳水化合物的含量[11]；以牛血清蛋白为标准品，采用考马斯亮蓝染色法测定黑豆皮提取物中蛋白质的含量[12]；以半乳糖醛酸为标准品，采用间羟基联苯法测定黑豆皮提取物中糖醛酸的含量[13]。

比较黑豆皮提取物中6种活性成分的含量，确定合适的浸提温度。

1.2.3 黑豆皮提取物抗氧化活性的测定

取合适温度下浸提的黑豆皮提取物，溶解并稀释成不同浓度，测定其总还原力和对DPPH自由基的清除能力，体外评价其抗氧化活性[14-15]。具有还原能力的化合物能将铁氰化钾还原为亚铁氰化钾，并与三氯化铁发生显色反应，产物在702 nm处显色，基于此，可通过测定702 nm处吸光度(OD702)来判断化合物还原能力的强弱，OD702值越大，说明还原能力越强。DPPH自由基能够和抗氧化剂反应，测定溶液在517 nm处吸光度，通过计算DPPH自由基清除率来判断抗氧化剂的活性，DPPH自由基清除率越高，抗氧化活性越高[16]。

1.2.4 黑豆皮提取物抗肿瘤活性的测定

取合适温度下浸提的黑豆皮提取物，通过MTT法体外评估其对BGC-823、HeLa、NCI-H460细胞株增殖活性的影响[17]。将对数生长期的BGC-823、HeLa、NCI-H460细胞株分别用胰蛋白酶消化，并分别用含10%(体积分数)胎牛血清的RPMI-1640培养基和DMEM培养基制成细胞悬液；接种于96孔板，密度为1×106个·mL-1，待细胞贴壁后，加入不同浓度(0.125 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1)合适温度下浸提的黑豆皮提取物溶液，置于37 ℃培养箱中培养24 h；加入MTT处理4 h，弃上清，每孔加入100 μL二甲基亚砜，测定570 nm处吸光度(OD处理组)。以磷酸盐缓冲液替代黑豆皮提取物溶液作为空白组，同法测定570 nm处吸光度(OD空白组)，按下式计算抑制率(%)：

1.3 数据分析

实验数据用Excel计算平均值和标准差，使用GraphPad Prism 5.0软件完成统计绘图。

2 结果与讨论

2.1 黑豆皮提取物中活性成分分析

在70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃下浸提的黑豆皮提取物中的总黄酮、总酚、花青素、碳水化合物、蛋白质和糖醛酸等6种活性成分的含量如图1所示。

图1 黑豆皮提取物中6种活性成分的含量Fig.1 Contents of six active components in black bean hulls extract

由图1可知，黑豆皮提取物中的总黄酮、总酚、花青素、蛋白质和糖醛酸等5种活性成分的含量随着浸提温度的升高均呈先升高后降低的趋势，在90 ℃时总黄酮、总酚、蛋白质和糖醛酸的含量达到最高，分别为(11.555±0.160)%、(1.454±0.070)%、(13.096±0.600)%、(21.587±1.570)%；在80 ℃时花青素的含量达到最高，为(0.199±0.003)%；而黑豆皮提取物中碳水化合物的含量随着浸提温度的升高持续升高，在90 ℃时为(61.453±5.030)%，100 ℃时达到(65.566±1.448)%。

采用1.2.1方法在不同温度下浸提的黑豆皮提取物的提取率顺序为：90 ℃(7.957%)>100 ℃(7.904%)>70 ℃(5.356%)>80 ℃(5.343%)。综合考虑，选择合适的浸提温度为90 ℃，在此温度下浸提能够最大程度地保留黑豆皮中的各种活性成分。

2.2 黑豆皮提取物的抗氧化活性分析

取80 ℃、90 ℃下浸提的黑豆皮提取物，体外测定其总还原力和DPPH自由基清除率，结果如图2所示。

图2 黑豆皮提取物的总还原力(a)和DPPH自由基清除率(b)Fig.2 Total reducing power(a) and DPPH free radical scavenging rate(b) of black bean hulls extract

由图2可知，90 ℃浸提的黑豆皮提取物的总还原力和DPPH自由基清除率均高于80 ℃浸提的；且2种温度下浸提的黑豆皮提取物的总还原力和DPPH自由基清除率均随提取物浓度的增加逐渐升高，呈线性关系。90 ℃浸提的黑豆皮提取物浓度为0.8 mg·mL-1时，其还原铁离子和对DPPH自由基的清除能力均达到最强，铁离子还原氧化值和DPPH自由基清除率分别达到1.364±0.120和(76.00±0.02)%。

2.3 黑豆皮提取物的抗肿瘤活性分析

取80 ℃、90 ℃下浸提的黑豆皮提取物，体外测定其对BGC-823、HeLa、NCI-H460细胞株增殖活性的影响，结果如图3所示。

图3 黑豆皮提取物对BGC-823(a)、HeLa(b)、NCI-H460(c)细胞株增殖活性的影响Fig.3 Effect of black bean hulls extract on proliferative activity of BGC-823(a),HeLa(b),and NCI-H460(c)

由图3可知，黑豆皮提取物具有抑制癌细胞增殖的作用。在浓度为0.25～2 mg·mL-1时，80 ℃下浸提的黑豆皮提取物能够抑制BGC-823细胞株增殖，并呈浓度依赖关系，在浓度为0.125～2 mg·mL-1时，90 ℃下浸提的黑豆皮提取物也能够抑制BGC-823细胞株增殖，并呈浓度依赖关系(图3a)；在浓度为0.5～2 mg·mL-1时，黑豆皮提取物能够抑制HeLa细胞株增殖，并呈浓度依赖关系(图3b)；在浓度为0.5～2 mg·mL-1时，黑豆皮提取物能够抑制NCI-H460细胞株增殖，并呈浓度依赖关系(图3c)。90 ℃下浸提的黑豆皮提取物在浓度为0.125 mg·mL-1时就对BGC-823细胞株的增殖具有一定抑制效果，说明其对人胃腺癌细胞更加敏感。

2.4 讨论

有报道指出，黑豆中含有丰富的黄酮类化合物、多酚类化合物、碳水化合物、蛋白质和维生素等，能够增强机体免疫力并调节机体激素水平，有效减轻妇女更年期综合症症状[18]。本研究对黑豆皮提取物中6种活性成分的热稳定性进行研究，发现90 ℃浸提的黑豆皮提取物中总黄酮、总酚、蛋白质和糖醛酸的含量最高，而花青素在80 ℃时保留最多，碳水化合物在100 ℃时保留最多。这是由于，总黄酮、总酚等物质的性质较稳定，在一定范围内随着温度的升高提取量逐渐增加[19-20]；花青素是一种热敏性较高的物质，结构不稳定，温度越高越容易被氧化分解[21]；碳水化合物是生命细胞结构的主要成分和供能物质，具有调节细胞活动的重要功能，众多研究表明温度对碳水化合物结构与性质的影响较小[22]，因此，100 ℃浸提的黑豆皮提取物中碳水化合物含量最高。

已有大量的生物学和医学研究证实，氧化应激是导致各种疾病发生的关键机制，减少机体内自由基的产生是有效调节氧化应激的重要策略[23]。机体内过多的活性氧(如氧自由基)引起的氧化应激是人类多种疾病发生发展与人体衰老的一个重要因素[24]。植物中抗氧化活性成分主要有黄酮类化合物、多酚类化合物、维生素和多糖等，其中花青素是目前最有效的抗氧化剂，也是最强效的自由基清除剂[25-26]。

本研究发现黑豆皮提取物具有较强的抗氧化活性，对DPPH自由基的清除率达到了(76.00±0.02)%，铁离子还原氧化值达到了1.364±0.120。这与李勇等[27]研究发现黑豆皮具有抗氧化活性的结果相印证。同时推测槲皮素、异鼠李素、染料木素、豆素和原儿茶酸甲酯等物质与花青素、多糖协同参与了黑豆皮提取物的抗氧化作用，有效地抑制和清除自由基，减少机体的氧化损伤。

本研究还发现黑豆皮提取物能够有效抑制BGC-823、HeLa和NCI-H460细胞株的增殖。低浓度时，黑豆皮提取物促进癌细胞增殖；达到一定浓度时，抑制癌细胞增殖。这应该与黑豆皮提取物中各活性成分所占比例有关。黑豆皮提取物中碳水化合物等营养物质含量高，所以低浓度时营养物质首先提供营养和能量促进癌细胞增殖，随着浓度的升高，花青素、黄酮等具有抗肿瘤活性的化合物发挥作用，抑制癌细胞增殖。Singh等[28]和Wang等[29]研究发现，大豆皂酚B和染料木黄酮能够促进大肠癌细胞的凋亡和自噬，诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成，因此推测黑豆皮提取物中可能含有皂酚B、染料木黄酮等其它活性成分协同参与了抗肿瘤作用。

3 结论

在90 ℃下用蒸馏水浸提黑豆皮获得的黑豆皮提取物中总黄酮、总酚、蛋白质和糖醛酸保留最多，含量分别为(11.555±0.160)%、(1.454±0.070)%、(13.096±0.600)%、(21.587±1.570)%；花青素含量在80 ℃浸提时达到最高，为(0.199±0.003)%；而碳水化合物的含量则在100 ℃浸提时达到最高，为(65.566±1.448)%。黑豆皮提取物具有显著的抗氧化和抗肿瘤活性，能够有效抑制机体自由基的产生，增强免疫力，预防和抑制机体发生癌变，降低癌症发生几率。表明黑豆皮提取物能够作为一种天然抗氧化或抗肿瘤的调节剂应用于食品药品行业，为黑豆皮资源的产业化开发利用奠定了重要基础。