基于matK 序列的24 个茶树品种亲缘关系

卓雄标，陈美霞，彭成彬，王泽榕，张月华，沈小莲，刘 伟*

（1.宁德师范学院 资产后勤管理处，福建 宁德 352100；2.宁德师范学院 生命科学学院，福建 宁德 352100；3.福建省科技厅产学研合作示范基地，福建 宁德 352100）

茶（Camellia sinensis(L.) O.Kuntze）属山茶科山茶属的双子叶植物.福建福安的产茶历史悠久，素有“中国茶叶之乡”之称.随着人们生活水平的提高，对茶的需求量也在增加，茶叶的产量与销量成为限制当地农民经济来源的主要因素之一.由于茶树的杂交育种现象越来越多，与母系越来越难区分，种间同名异物或同物异名的现象时常发生，阻碍了茶树资源的保护、保存和综合利用，单从形态学特征已经难以区分，亟需在分子水平进行更准确地鉴定.

2003年，Hebert 等［1-2］首次提出了“DNA 条形码”，DNA 条形码是通过一段或几段通用的标准DNA 序列对物种进行识别和鉴定的技术，已成为物种鉴定及发现新的或隐性物种的有用工具.2009 年国际条形码联盟将matK基因推荐为陆地植物核心条码候选片段之一［3］，因为该基因属于叶绿体基因组上的赖氨酸trnK基因内含子的一部分，参与RNA 转录体中II 型内含子剪切，是进化速率最快的单编码基因之一.Kondo 等［4］采用rbcL基因和Fushimi 等［5］采用18SrRNA基因对川芎和日本川芎进行分析发现序列完全相同，刘玉萍等［6］利用matK基因和ITS基因进行再次分析，发现川芎与日本川芎间matK基因、ITS基因均有1 个变异位点，结合之前的研究结果，作者认为中日所产川芎基原一致，日本川芎学名应改为Ligusticum chuanxiongHort.，这也充分说明该标记的有效性.需注意的是matK基因应用在不同物种扩增时，体系、反应程序、结果不是完全一致，因此，首先要对引物进行筛选.杨俊波等［7］通过matR基因序列分析表明传统山茶亚科和厚皮香亚科不构成姐妹群关系.宋艳波等［8］对22 个核桃品种进行鉴定，发现有17个SNP 位点，可以准确区分早、晚实核桃类群，在不同种间关系研究只能划分遗传差异较大者，可为品种筛选提供初步信息.

虽然已有很多matK基因的研究报道，但却鲜见其在茶树物种方面的研究.本实验通过matK基因对24个茶树品种进行分析，探索该技术在茶树品种鉴定中的适用性，为茶树DNA 条形码的开发提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

2019 年，在福建省农业科学院茶叶研究所采集24 个茶树品种的鲜叶，选无病害的一芽一叶或二叶，采样时间为上午8:00—10:00.样品基本信息见表1.

表1 供试材料基本信息

1.2 DNA 提取及检测

参照天根生化科技(北京）有限公司的植物基因组DNA 提取试剂盒说明书，提取样本总基因组DNA.用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 纯度，用超微量紫外可见分光光度仪检测DNA 浓度.

1.3 PCR 扩增及序列测定

通用引物 matK 基因序列为 CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG 和 ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC，PTC-100 PCR 仪进行扩增.反应体系：DNA 模板2.0 μL，正反向引物（10 μmol·L-1）各1.0 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 补齐至25 μL.扩增程序：94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50s，35 个循环；72 ℃延伸10 min.产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，合格PCR 产物委托福州博尚（尚辰）生物技术公司进行双向测序及序列拼接.

1.4 茶树matK 基因片段的序列分析及鉴定

采用MEGA 7.0 软件对所得基因片段进行比对分析，统计片段长度、变异位点，构建邻接(Neighbor joining，NJ)系统发育树和最简约(Maximum parsimony,MP)系统发育树.采用DNA star 软件计算不同样本之间的遗传距离.

2 结果与分析

2.1 DNA 提取及检测

本研究利用植物基因组DNA 提取试剂盒提取24 份茶树基因组DNA，进行1%琼脂糖凝胶电泳，由图1 可以看出，点样孔附近干净无杂带，说明没有蛋白质污染.

图1 部分茶树基因组DNA 电泳图

因茶树富含多种物质，基因组DNA 经检测后发现部分样品D（260）/D（280）比值超过2.0，推测在提取过程中出现了核酸降解，或者DNA 不纯，有RNA 存在.为了获得纯度较好的基因组DNA，再次纯化，由表2 可以看出，参试样本的D（260）/D（280）值集中在1.8～2.0 之间，符合下一步实验要求.24 份参试样品的总浓度多在80 ng·μL-1以上，仅有样品编号FA1 和FA24 两份样品浓度低于80 ng·μL-1,分别是65 和63 ng·μL-1，这说明提取的总DNA 浓度较高，该试剂盒适合用于茶树基因组DNA 提取.为了保证样品的纯度，可增加一次氯仿、异戊醇的去蛋白纯化过程.

表2 DNA 质量检测结果

2.2 PCR 扩增与测序

不同样本matK 基因的PCR 扩增结果如图2 所示，产物片段为750～1 000 bp 之间的特异条带，条带单一、清晰、明亮，说明PCR 扩增成功，可直接测序.

图2 茶树matK 基因片段的PCR 结果

2.3 matK 基因变异分析

对测序的24 个样本的基因序列进行分析，长度介于720～900 bp 之间，存在21 个变异位点（表3），分别发生在第126、130、151、161 bp 处的T-A 的颠换，第127、291 bp 处的A-G 的转换，第128 bp 处的T-C 的转换，第136 bp 处的C-G 的颠换，第137、142、143、162 bp 处的G-T 的颠换，第138、139、146 bp处的A-T 的颠换，第145、270 bp 处的C-T 的转换，第156、292 bp 处的G-A 的转换，第163 bp 处的AC 的颠换，第160 bp 处的C-A 颠换和C-T 转换,第160 bp 处的C-A 颠换频率为22.2%，C-T 转换频率为77.8%.从表3 也可以得出，FA14（早春毫）的变异位点最多，有18 个；FA3（黄观音）、FA7（黄玫瑰）、FA8（朝阳）、FA24（未命名）各有2 个变异位点；FA4（悦铭香）、FA10（九龙袍）、FA19（红芽佛手）、FA21（白芽奇兰）、FA22（霞浦元宵绿）各有1 个变异位点.

表3 24 个茶树品种matK 序列变异位点

2.4 遗传距离分析

24 个茶树品种的matK 序列多重比较并生成遗传距离示意图（图3），可看出参试样本种间遗传距离分化系数在0～4.3 之间，百分比为97.2%～100%.FA14（早春毫）与其它品种的分化系数相比，其分化系数最大，平均为2.54，百分比最小为97.3%.

图3 24 个茶树物种的遗传距离示意图

2.5 构建进化树

24 个茶树品种matK 序列的NJ 系统发育树如图4 所示，FA14 单独聚为一支，与其他品种差异明显；FA4、FA10、FA19、FA21、FA22 聚为一支；FA7、FA24、FA3 聚为一支，其中FA7 和FA24 亲缘关系较FA3 近；其余15 个样本聚为一支.构建的MP 系统发育树如图5 所示，FA14 单独聚为一支，FA7、FA24、FA3 聚为一支，与NJ 系统发育树一致；其余20 个样本聚为一支，其中NJ 系统发育树单独聚为一支的FA4、FA10、FA19、FA21、FA22，在MP 系统发育树仍然聚在一起，两种构建方法得到的结果基本一致.

图4 基于matK 序列构建的NJ 系统树

图5 基于matK 序列构建的MP 系统树

3 讨论与结论

本实验对matK 序列进行变异位点分析，总变异位点21 个，其中早春毫的变异位点有18 个，该品种是福建农科院茶叶研究所从迎春的自然杂交后代中采用单株选种法育成的，这可能也是早春毫与其他山茶属之间亲缘关系较远的原因.

在不同品种之间的鉴定，很难找到一种单一的DNA 条形码来区分所有样品，NJ 法和MP 法两种建树方法，24 个样本仅可以分为4 大类，且只有早春毫可以明显的被区分，其余样本之间差异不够明显，说明matK 基因在分析种间的亲缘关系还是比较困难.不同学者针对不同物种提出了多种序列组合分析的方案，今后拟考虑扩大序列组合，增加叶绿体基因组非编码基因片段trnH-psbA 序列和核基因组内转录间隔序列ITS，提高不同品种之间鉴定率.

本实验研究了24 个茶树品种的matK 基因，近3＇ 端比较保守区域，差异相对较小，序列长度在720～900 bp 之间，已报道完整的不同物种matK 基因全长约1 500～2 000 bp，接下来在现有序列基础上重新设计引物对全长进行克隆，预测氨基酸组成，引入外类群对山茶属不同物种的亲缘关系进行准确鉴定.