乙醇的遗传毒性研究

王天威 张文众研究员 胡 洋 马志远 张梦利

(1.潍坊医学院 公共卫生学院，山东 潍坊 261000；2.华北科技学院 安全工程学院，河北 三河 065201)

0 引言

乙醇作为一种有机化合物可以作为化工原料、生化试剂、溶剂和助溶剂等，应用非常广泛。密切接触乙醇者面临着醉酒、过敏和中毒等一系列健康问题。世界卫生组织发布的《2018年全球酒精与健康状况报告》中提到，乙醇导致7.2%的人过早死亡，2016年全球因乙醇导致死亡的约300万人(占全年所有死亡人数的5.3%)。由于乙醇应用广泛，且会给接触者带来众多健康风险，对长期密切接触乙醇的从业人员有可能造成不同程度的机体损伤。目前国内外对于乙醇的遗传毒性和靶器官实验研究中，体外研究发现乙醇可以造成胃黏膜细胞、结肠粘膜细胞和淋巴细胞DNA断裂。Narendra P.Singh等利用不同年龄段人体原代淋巴细胞作为实验模型发现乙醇的代谢产物乙醛可以导致DNA单链和双链断裂。M.A.Kayani等利用体外微核试验根据染色体着丝点不同发现乙醇和乙醛通过不同途径产生遗传毒性。体内研究发现乙醇诱导染色体畸变实验绝大多数表现为阴性，只有极少数微核实验为阳性，虽然已有少数研究证明乙醇具有遗传毒性，但总体研究相对较少且不完整。乙醇对职业人群的影响并不明确。因此，本研究采用体外实验和体内实验相结合的方式探索乙醇的遗传毒性和靶器官，为预防和控制乙醇对职业人群健康的影响提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

主要仪器：BS224S型电子天平、CR21GII型高速离心机、生物显微镜、水浴锅、IX71型荧光倒置显微镜。

试剂和分析系统：胎牛血清、Giemsa染液、甘油、甲醇、无水乙醇。彗星试验试剂盒、彗星试验电泳系统、彗星图像智能分析软件(Comet A1.0)。

1.2 脱细胞彗星试验方法

1.2.1 细胞核DNA的制作

细胞核DNA的制作用参考文献[8]的方法并进一步优化。选用未经处理、生长状态良好的细胞，用细胞核提取液提取其细胞核。把细胞核悬浮在包埋剂中，浓度调整至10个/ml，按一定的密度固定在平面载体上，去除核膜，做成细胞核DNA板。乙醇直接作用于脱细胞核DNA染毒1h，置于4℃碱性电泳液(PH≥13)解旋30min，20V电泳20min，以尾部DNA含量(简写，DNA%)作为分析指标，观察碱性环境下乙醇对脱细胞核DNA的影响。该细胞核DNA板的包埋剂即可维持细胞核DNA的完整性(完整性：即维持其圆球形不变，DNA链无断裂)。

1.2.2 乙醇染毒

预先放置制备好的脱细胞核DNA板，将乙醇浓度分别设置为0.00%、0.06%、0.13%、0.25%、0.50%、1.00%、10.00%、25.00%、50.00%、100.00%，共10个组，每组10张载玻片，染毒1h。脱细胞核DNA板的检测采用脱细胞彗星试验检测DNA的断裂。

1.3 体内彗星试验和微核试验方法

彗星试验参照《哺乳动物体内碱性彗星试验》(GB 31655-2021)开展。微核试验参照《哺乳动物红细胞微核试验》(GB 15193.5-2014)开展。彗星试验与微核试验共用一批动物。

1.3.1 实验动物与场所

实验动物：无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)级SD大鼠100只，雌雄各半。体重200±20g，出生后天数(Postnatal Day，PND)42天，发育表现正常。购买的动物进入实验室后适应环境3天，适应期进行检疫和观察，期间自由饮水和摄食。

实验场所：潍坊医学院科技楼C医学实验动物中心。

1.3.2 动物染毒剂量、方法和分组

实验动物随机分为5组，每组20只，雌雄各半。阴性对照组为水，阳性对照组为每千克体重40mg(40mg/kg bw)环磷酰胺(CP)，乙醇剂量组(低、中、高)按2倍倍比关系稀释，分别为1、2、4g/kg bw。2次给受试物间隔24h，第2次给受试物后6h，动物取材开展彗星试验和骨髓微核试验。

1.3.3 靶器官单细胞悬液制备

肝脏单细胞悬液制备：取1cm肝脏剪碎后放入离心机低速离心，弃上清制成细胞悬液。

骨髓单细胞悬液制备：剪取股骨，于臀肌粗隆处剪去一端露出骨髓，用Hank's液将骨髓冲出。

外周血单细胞悬液制备：使用毛细管眼眶静脉丛取外周血1ml，加入乙二胺四乙酸二钠抗凝全血。采样后立即进行制片处理，减少间隔时间，并保证每个样品从取样到制片间隔时间一致。

1.3.4 样品的处理顺序

样品做平行处理，即不同剂量组动物随机选择每组各一只采样，每张载玻片上各组样品随机排放。

1.3.5 制片、裂解、解旋及电泳

单细胞悬液10μl加入70μl上样胶(0.5%低熔点琼脂糖)滴加在已经铺有第1层琼脂糖的彗星试验专用载玻片上，立即盖上盖玻片，置4℃冰箱10min固化，移去盖玻片；再滴加70μl上样胶作为第3层。每个标本制2-3张玻片，放置备用。裂解液提前放入4℃冰箱至少30min。将玻片浸入预冷的细胞裂解液中，裂解液应没过玻片，放置于4℃冰箱避光裂解4h。裂解完成后，从裂解液中取出载玻片，用纯水漂洗3次，每次5min，去除过多的盐。再将玻片置于水平电泳槽中，缓缓加入新鲜配制的电泳缓冲液，使液面高于载玻片2mm，把电泳槽置于4℃冰箱中，避光解旋20min。取出电泳槽，调节电压为20V，电泳20min。电泳完毕，取出载玻片，用中和缓冲液漂洗3次，每次5min。

1.3.6 染色、拍照和分析

滴加Gelred荧光染料避光染色，约2min。在荧光显微镜下，用10×10倍数阅片。选择玻片同一密度的几个区域，以确保没有重叠的尾，避免在玻片的边缘进行评分。可以观察到DNA碎片从细胞的“头”移到“尾”，彗头为圆形、边缘光滑整齐，彗尾紧随彗头之后，呈散点状拖尾。彗星拖尾的长度与DNA的损伤程度相关。对所有玻片进行独立编码和盲号阅片。用CometA1.0专业软件定量分析。每只动物分析200个细胞的尾部DNA%。

1.3.7 骨髓微核试验方法

取单侧股骨并用Hank's液冲洗骨髓离心弃上清制备骨髓细胞悬液。将小牛血清滴于载玻片上与骨髓细胞悬液混匀，手工涂片并放入甲醇固定。固定好的样本经Giemsa应用液染色。镜检计数：选择细胞完整、分散均匀，着色适当的区域，每只动物在油镜下计数200个嗜多染红细胞(Polychromatic Erythrocytes，PCE)和正染红细胞(Normochromatic Erythrocyte，NCE)计算PCE所占比例，并观察计数至少2 000个PCE，观察微核(Micronuclei，MN)发生率。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 脱细胞彗星试验

脱细胞碱性和中性彗星试验结果，见表1。乙醇浓度从0.00%～100%染毒，脱细胞核DNA彗星尾部DNA%与对照组相比无差异(

P

>0.05)。

表1 脱细胞彗星试验结果

2.2 体内彗星试验

2.2.1 骨髓彗星试验

骨髓碱性彗星试验结果，如图1。乙醇低剂量组、中剂量组和阳性对照组尾部DNA%明显高于对照组(

P

<0.05)，高剂量组尾部DNA%与对照组相比无差异(

P

>0.05)。雄性和雌性大鼠骨髓细胞尾部DNA%相比无差异(

P

>0.05)。骨髓中性彗星试验结果，如图2。阳性对照组尾部DNA%明显高于对照组(

P

<0.05)乙醇各剂量组尾部DNA%与对照组相比无差异(

P

>0.05)。

注：碱性彗星试验，雄性大鼠低、中、高剂量组和阳性对照组与溶剂对照组相比P值分别为0.001*、0.001*、0.485、0.001*碱性彗星试验，雌性大鼠低、中、高剂量组和阳性对照组与溶剂对照组相比P值分别为0.001*、0.001*、0.738、0.001*中性彗星试验，雄性大鼠低、中、高剂量组和阳性对照组与溶剂对照组相比P值分别为0.984、0.825、0.657、0.001*中性彗星试验，雌性大鼠低、中、高剂量组和阳性对照组与溶剂对照组相比P值分别为0.987、1.000、0.980、0.001**与溶剂对照组比较，P<0.05

图2 大鼠骨髓细胞碱性彗星图片

2.2.2 肝脏彗星试验

肝脏碱性彗星试验和中性彗星试验，见表2。乙醇各剂量组尾部DNA%与对照组相比无差异(

P

>0.05)。

表2 大鼠肝脏细胞彗星试验结果

2.2.3 外周血彗星试验

外周血碱性彗星试验和中性彗星试验结果，见表3。乙醇各剂量组尾部DNA%在与对照组相比无差异(

P

>0.05)。

表3 大鼠外周血细胞彗星试验结果

2.3 骨髓微核试验

骨髓微核试验结果，见表4。乙醇各剂量组PCE/NCE比值与对照组相比无差异，阳性对照组PCE/(PCE+NCE)比值与对照组比值之差小于20%。乙醇各剂量组MN率与对照组相比无差异(

P

>0.05)，阳性对照组MN率明显高于对照组(

P

<0.05)。

表4 骨髓微核试验结果

3 讨论

脱细胞彗星试验是基于去除细胞膜和核膜形的细胞核DNA作为模型与受试物直接反应，避免细胞膜和核膜阻碍受试物。本研究以脱细胞核DNA为模型观察乙醇造成的DNA损伤，为乙醇的遗传毒性识别提供快捷、高效的分析方法。脱细胞彗星试验结果显示，乙醇无法直接导致DNA链断裂的作用。不排除乙醇和DNA形成了加合物/交联物，导致DNA彗尾无法形成。本课题组之前已成功建立脱细胞、肝脏和外周血细胞彗星试验阳性对照模型，故本实验没再重复。

注：*与溶剂对照组比较，

P

<0.05

肝脏是乙醇代谢的主要场所，90%以上的乙醇经由肝脏进行降解清除。乙醇是一种已知致癌物，其机制与乙醇的代谢产物乙醛，以及乙醇所诱导的氧化应激反应有关。还可以通过甲基化与活性氧诱导表观遗传。乙醇在体内通过乙醇脱氢酶生成乙醛，在内质网上生成损害机体的活性氧，当摄入过量乙醇时，来不及代谢的乙醇及其代谢产物经由血液到达全身各处。体内研究发现，短期和长期暴露乙醇导致小鼠外周血白细胞DNA单链断裂。但本研究结果显示：短期乙醇暴露不会导致肝脏和外周血细胞DNA单链和双链的断裂。

在本研究中，乙醇所导致的骨髓细胞DNA单链断裂呈现倒置的“U”字形。在一定剂量范围内，乙醇的过量摄入使得体内乙醛无法及时清除，导致体内乙醛浓度上升对细胞DNA造成损伤。活性氧的生成也是DNA损伤的关键。乙醇氧化成乙醛产生大量活性氧，这些活性氧通过细胞色素P450形成羟自由基进而诱导脂质过氧化反应并最终导致细胞DNA的损伤。本研究中随着剂量的增加，高剂量组无法观测到DNA单链的断裂。推测是由于过量乙醇摄入，大量氧化成的乙醛来不及转化为无害的乙酸，这些突然增多的乙醛有可能与DNA结合形成DNA加合物，乙醇也能够明显诱导过度表达CYP4502E1的HepG2细胞DNA加合物的形成，本课题组在前期研究中发现乙醛与DNA形成加合物/交联物阻碍了DNA断片的移动。

微核试验有假阳性结果低、方便快捷的特点，常用于检测细胞染色体断裂。长期乙醇暴露实验中，体外研究表明乙醇对2种淋巴细胞染毒导致MN数量升高，体内研究表明乙醇对小鼠暴露32周后进行骨髓微核试验，未发现染色体断裂。由此可见，长期体外和体内乙醇暴露导致染色体断裂结果不一致，本研究短期体内乙醇暴露也未发现染色体断裂。提示体内骨髓微核不是乙醇遗传毒性的敏感生物标志物。

4 结论

骨髓是短期体内乙醇暴露致DNA断裂的靶器官；骨髓细胞彗星试验DNA损伤呈倒置的“U”字形。本研究仅分析了乙醇导致DNA单链和双链断裂作用，因为DNA加合物的形成会阻碍DNA断片的移动，肝脏和外周血以及高剂量组骨髓细胞未观察到DNA断裂并不代表DNA没有受到损伤，可能是乙醇直接或间接与DNA形成加合物，因此在未来的研究中需要进一步探索乙醇所导致的DNA加合物剂量—反应关系及其机制。乙醇作为世界卫生组织公布的已知致癌物，对其遗传毒性和靶器官的研究较少，本研究所能检索到的文献大都较久远，对于此方面研究亟待拓展。