长链非编码RNAs靶向软骨炎症信号通路调节骨关节炎的研究进展

薛若雪，汤苏安，阮光峰，丁长海，朱兆华

(南方医科大学珠江医院临床研究中心，广东 广州 510000)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)以软骨厚度丢失、骨质增生和关节周围组织退变为特征性病理改变。OA长期被认为是一种非炎症性、退行性疾病，但近年来越来越多的研究认为慢性炎症是导致OA的重要原因[1]。据报道，OA患者关节液中有大量活化的巨噬细胞[2]、T细胞和B细胞，抑炎因子水平也高于非OA人群[3]。临床前研究发现，炎症通路的抑制剂可以延缓OA的发展[4]，观察性临床研究表明，系统性低度炎症与OA疾病发生和进展密切相关[5]，这些证据都显示炎症参与了OA的发生及发展。OA软骨中调控炎症的主要信号通路有NF-κB、JAK/STAT、MAPK和PI3K/AKT/mTOR等，新近研究发现长链非编码RNAs (long noncoding RNAs，LncRNAs)可以通过调节软骨炎症信号通路参与OA的疾病进程[6]。

研究表明仅有2%的人类基因负责编码蛋白，近年来研究发现这些剩余非编码基因可以转录大量的非编码RNAs(non-coding RNAs，ncRNAs)，而这些ncRNAs具有调节基因表达的重要作用。长度大于200个核苷酸的ncRNAs被称为LncRNAs，根据相对于蛋白编码基因的位置不同，LncRNAs又可以分为反义LncRNAs、伪基因LncRNAs、增强子LncRNAs、内含子LncRNAs和长基因间非编码RNAs[7]。LncRNAs的主要作用有抑制mRNA表达，影响其翻译、剪切及稳定性；作为非编码小RNA(microRNA，miRNA，长度约为20-25 nt)的分子海绵，影响miRNA稳定性；表观修饰DNA，影响基因的转录和表达；作为蛋白相互作用的桥梁、调控蛋白活性等[7]。

由于LncRNAs保守性差，不同物种间差异较大，因此本综述主要汇总了人类OA软骨组织和细胞中关于LncRNAs参与调控炎症信号通路的研究，作者以“骨关节炎”、“信号通路”、“软骨细胞”、“炎症”、“osteoarthritis”、“chondrocyte”、“inflammatory signaling pathway”、“MAPK”、“PI3K/Akt”、“IL-6/STAT3”、“NF-κB”、“JAK/STAT、“Notch”等为关键词，在Pubmed、NCBI、ResearchGate、Springer、知网、万方、维普等数据库中进行检索，筛选与LncRNAs通过炎症信号通路调节OA相关的文献。

纳入标准：①OA发生发展相关的文献；②软骨细胞相关的文献；③OA炎症信号通路相关的文献；④LncRNAs调控OA发生发展的文献；⑤发表时间在2014年1月至2021年4月的文献。排除标准：①获取不到全文；②非中、英文的文献；③证据等级及质量相对较低的文献；④作用机制非炎症信号通路的文献；⑤LncRNAs来源非人类的文献。共检索得到449篇文献，摘要及全文阅读后排除413篇文献，重点阅读剩余的29篇文献，并列出LncRNAs通过炎症通路调节OA进展的详情表(Tab 1)，分别介绍如下。

1 NF-κB信号通路

核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)属于Rel家族的转录因子，几乎存在于所有多细胞有机体中。NF-κB信号通路可通过增加炎症因子interleukin (IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-17及tumor necrosis factor (TNF)-α的表达、调控基质金属蛋白酶生成，促进软骨细胞炎症和凋亡反应进而导致OA的发生和进展[7]。

当前研究已经发现有3个LncRNAs可能参与了NF-κB信号通路相关的OA。一是LncRNA GAS5，其过表达可以通过上调KLF2表达抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的ATDC5软骨细胞炎症损伤和凋亡[8]。KLF2是参与NF-κB和Notch信号通路的关键酶，也是LncRNA GAS5的作用靶点[9-10]。另一个通过NF-κB调节OA的LncRNA是RP11-445H22，研究发现LncRNA RP11-445H22的敲除可以缓解LPS诱导的关节软骨细胞损伤，提高细胞活力、抑制炎症和凋亡因子表达[11]。RP11-445H22与miR-301a结合，而CXCR4是miR-301a的作用靶点，CXCR4的沉默会阻断LPS诱导的NF-κB和MAPK/ERK信号通路[11]。此外，有学者观察到在LPS损伤的软骨细胞中LncRNA ATB表达下调[12]，而过表达LncRNA ATB可明显减轻LPS诱导的ATDC5细胞炎性损伤。进一步实验表明，LncRNA ATB通过下调LPS损伤细胞中的miR-223来抑制髓样分化因子/NF-κB通路，从而保护ATDC5细胞免受LPS诱导的炎症性损伤。

Tab 1 LncRNAs regulate OA through inflammatory pathways

抑制NF-κB信号转导将会对OA及相关的慢性炎症性疾病起治疗作用。但是NF-κB广泛调节机体的免疫反应和细胞凋亡，具有多个作用靶点，这要求NF-κB抑制剂必须更加精准。因此，研究LncRNAs靶向调控NF-κB在OA发病机制中的作用，可为OA的靶向治疗提供新策略。

2 IL-6/STAT3或JAK/STAT通路

白介素6/信号转导与转录激活子(interleukin-6/signal transducer and activator of transcriptions，IL-6/STAT3)或Janus激酶/信号转导与转录激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcriptions，JAK/STAT)通路与炎症和免疫有重要关系，IL-6刺激JAK受体发生磷酸化，磷酸化JAK又是STAT分子的识别和结合位点，STAT分子因此被诱导进行磷酸化，磷酸化STAT分子以二聚体形式进入胞核，调节特定基因的表达[11]。近期研究报道有四个LncRNAs与STAT通路介导的OA软骨损伤有关。IL-6刺激后ATDC5 细胞活力降低，并通过下调microRNA-146a的表达进而上调Lnc CHRF的表达[13]，Lnc CHRF敲减后效果则相反。IL-6诱导IκBα、p65、JAK1和STAT3在磷酸化水平的积累进一步被Lnc CHRF促进。总之，Lnc CHRF通过STAT3信号通路加重了ATDC5细胞中IL-6诱导的炎症损伤。有研究者指出，LncRNA DANCR可作为miR-216a-5p的竞争性内源RNA来调控OA软骨细胞的凋亡[14]，而JAK2是miR-216a-5p的直接靶点，DANCR通过miR-216a-5p调控OA软骨细胞中的JAK2/STAT3信号通路，从而促进OA软骨细胞的增殖、减少细胞凋亡。此外，有研究发现LncRNA GACAT3在OA组表达显著高于照组，且这种上调可能与IL-6/STAT3炎症通路的激活有关[15]。最近一项关于LncRNA THRIL的研究发现THRIL在LPS诱导的软骨细胞炎症损伤中上调，且在miR-125b的参与下，THRIL可进一步活化软骨细胞中LPS诱导的JAK1/STAT3和NF-κB信号通路[16-18]。

3 MAPK信号通路

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路在细胞的生长、分化以及炎症反应等多种病理生理过程中发挥重要作用，是真核生物信号传递网络的关键途径之一，近年来在OA的研究中也越来越多。研究认为LncRNA RP11-445H22通过结合miR-310a进而沉默趋化受体因子(chemokine receptor，CXCR4)，CXCR4沉默可阻断LPS激活的MAPK/ERK通路，从而抑制ATDC5细胞的凋亡和炎症细胞因子分泌，显著逆转LPS诱导的软骨损伤[9]。LncRNA XIST也可以通过调节MAPK信号通路显著抑制IL-1β诱导的OA软骨细胞凋亡[19]。LncRNA XIST还可作为miR-211的内源性竞争RNA，对抗miR-211介导的CXCR4抑制，进一步抑制下游MAPK信号通路从而调控软骨细胞增殖和凋亡[19]。最近一项研究发现在OA软骨中，LncRNA HOTAIRM1-1在诱导间充质干细胞成软骨分化后4 d表达明显增加，8 d后进一步增强，而miR-125b表达则相反。进一步研究发现，LncRNA HOTAIRM1-1通过ceRNA机制直接抑制miR-125b的功能，进而上调潜在靶点BMPR2的表达，而BMPR2过表达抑制JNK/MAPK/ERK通路的激活，提示该通路可能是介导LncRNA HOTAIRM1-1在OA发展的下游机制[20]。

4 其他炎症调节相关通路

4.1 花生四烯酸通路炎症反应通过炎症介质诱导，而炎症介质主要由花生四烯酸通路产生，因此靶向抑制花生四烯酸通路的药物成为治疗关节炎症和疼痛的重要研究方向。事实上，临床试验证明环氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)抑制剂(如非甾体类抗炎药布洛芬等)可以减轻关节炎症状[19]。Krawczyk等[21]在2014年发现LncRNA PACER可能是调节COX-2的潜在靶点。随后Qian等[22]发现LncRNA PACER能够不通过NF-κB p50通路激活COX-2，而LncRNA PACER敲除后COX-2的过表达得到抑制，细胞增生和炎症得到缓解。2019年，Jiang等[23]研究发现在OA患者血浆中LncRNA PACER表达下调，并提示LncRNA PACER是Lnc HOTAIR的上游抑制剂，后者的过表达会导致软骨细胞凋亡。

4.2 Notch信号通路Notch信号通路在细胞生长、形态维持和凋亡等方面发挥重要作用，在进化中高度保守。有关LncRNAs通过Notch信号通路调节OA的研究极少。Saito等[25]发现LncRNA TUG1的表达在大黄素处理后上调，而Notch和NF-κB通路则被大黄素抑制。进一步的实验证明了大黄素通过上调LncRNA TUG1表达使Notch和NF-κB这两条通路失活。但是还没有实验证实LncRNA TUG1的敲除会延缓OA进展，也没有报道通过抑制LncRNA TUG1来预防和治疗OA。

4.3 PI3K/AKT/mTOR 信号通路有研究在缺氧条件下培养ATDC5软骨细胞，建立OA细胞模型，并测定OA与正常软骨组织中低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)和LncRNA HIFCAR的表达。结果表明OA中LncRNA HIFCAR和HIF-1α表达均上调，抑制LncRNA HIFCAR可促进细胞增殖、抑制凋亡、减少TNF-α和IL-6的分泌、抑制基质金属蛋白酶的合成从而显著改善缺氧诱导的细胞损伤[26]。此外，LncRNA HIFCAR能显著抑制缺氧诱导PI3K/AKT/mTOR途径的激活，提示PI3K/AKT/mTOR通路是LncRNA HIFCAR介导OA发展的一种可能机制。

5 在OA治疗中潜在应用价值

以LncRNAs为靶点治疗OA的实验已经在动物层面开展。Wang等[27]在2021年发表的文章中通过体内实验证实，敲低LncRNA SNHG14 可通过靶向miR-124-3p抑制FSTL-1介导的NLRP3激活和 TLR4/NF-κB信号通路激活，从而抑制炎症反应，缓解大鼠OA的进展。该文章通过动物实验证实了LncRNA SNHG14具有减轻OA炎症的治疗效果。Liu等[28]发现LncXIST在OA软骨组织和 IL-1β 处理的软骨细胞中以高水平表达，敲低Lnc XIST促进了细胞活力，抑制了IL-1β处理的软骨细胞中的细胞凋亡和细胞外基质 (ECM) 蛋白降解。进一步通过大鼠OA模型研究表明靶向抑制LncRNA XIST在体内具有OA治疗作用，其作用机制通过调节体内miR-149-5p/DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase 3 alpha，DNMT3A)轴的表达实现。Wang等[29]发现Lnc PVT1与关节软骨降解密切相关，而在实验动物关节内注射Lnc PVT1抑制剂可有效地减轻关节炎症，降低促炎介质的表达，并抑制了 TGF-β/母抗Dpp小同源物4(small mothers against decapentaplegic homolog 4，SMAD4)通路。提示通过抑制Lnc PVT1的表达，进而抑制 TGF-β/SMAD4通路，能够减轻关节炎症反应，在OA中具有潜在治疗效果。Han等[7]在最新发表的文章中研究了LncRNA MEG3对膝骨关节炎大鼠滑膜细胞增殖和凋亡的影响，研究发现LncRNA MEG3可提高第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白的同源基因(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)水平，减弱大鼠滑膜细胞的增殖能力，提高其凋亡水平，加重关节炎症反应，揭示了LncRNA MEG3能够通过改变大鼠PTEN表达水平进而调控滑膜细胞增殖和凋亡，从而影响OA疾病进程。因此，动物实验初步表明通过上调或下调特定的LncRNAs表达可以抑制相关炎症通路的表达，进而对OA起到治疗作用[29]。

6 讨论与展望

慢性低度炎症是OA发生发展的重要病因，OA的炎症亚型也受到越来越广泛的关注。LncRNAs在OA炎症机制中的研究是一个新的领域，其中起关键调控作用的LncRNAs有望成为OA治疗的新靶点[2]。目前已陆续有研究鉴定出一些在病变的关节组织中差异表达的LncRNAs，这些LncRNAs作为炎症通路的关键调控因子在OA中的功能已在体内外实验中得到确证[3]。虽然LncRNAs是OA潜在的诊断标志物和治疗靶点，但在应用到临床前，还有诸多挑战需要面对。首先，虽然有大量的LncRNAs在OA中具有差异性表达[4]，但目前只有很小部分LncRNAs的作用机制被阐明，而OA的多种临床症状很可能需要结合多种LncRNAs及其靶点来解释[15]。因此要阐明LncRNAs调节OA的作用机制，更为先进和高效的检测以及分析手段是必不可少的。其次，关于LncRNAs在OA软骨细胞中作用的研究大部分是在体外实验，还需要更多药理学可信服的验证数据。此外，如何平衡LncRNAs的高效性和低毒性，将需要更为先进的给药物递送系统[26]。 总之，深入研究OA炎症机制相关的LncRNAs将进一步为OA的预防和治疗提供新思路和新策略。