穿心莲内酯对小鼠乳腺癌的抑制作用和机制

鹿蓓蓓，傅鹤秀，Eric Achiborebador Okrah，郭文洁，高 静

(1. 江苏大学药学院，线粒体与神经生物学实验室，江苏 镇江 212013；2.南京大学生命科学学院，江苏 南京 210023)

乳腺癌是威胁全球女性癌症患者健康的恶性肿瘤之一，据2020年国际癌症研究机构最新数据显示[1]，在癌症分布类型上，乳腺癌新增人数达226万，成为全球第一大癌，且乳腺癌的发病率及死亡率仍高居女性癌症首位。癌症的代谢重编程被认为是许多恶性肿瘤的标志，近年来，对肿瘤代谢的广泛研究产生了许多旨在破坏这种代谢重编程的新的药物靶标和其他治疗策略[2]。穿心莲内酯(andrographolide，Andro)是我国传统中草药穿心莲的主要活性成分之一，具有抗炎[3]、抗菌[4]、抗癌[5]等多方面药理作用。但关于穿心莲内酯在体抑制乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤生长及其线粒体相关机制未见报道。本文拟探讨穿心莲内酯对乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用，并探讨其能量代谢相关的抗肿瘤机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及动物小鼠乳腺癌细胞株4T1，由江苏大学龚爱华教授惠赠。SPF级雌性BALB/c小鼠24只，(6～8)周龄，体质量(18～20)g，江苏大学实验动物中心，许可证号：SCXK(苏)2018-0012。

1.2 药品与试剂穿心莲内酯，由江西青峰药业提供；RPMI 1640培养基(31800022)，美国Gibco公司；胎牛血清(11011-8611)，浙江天杭生物科技股份有限公司；MTT，美国Amresco公司；5-Fu(F6173)，上海麦克林生化科技有限公司；乳酸(LD)测试盒(A019-2-1)，南京建成生物工程研究所；乙酰辅酶A检测试剂盒(ML712805)，MLBIO酶联生物；BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012S)、超敏ECL化学发光试剂盒(P0018S)，碧云天生物技术公司；JC-1，美国Thermo Fisher Scientific公司；一抗(β-actin、PDH)、鼠二抗，美国Proteintech公司；其余未特殊注明的试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器细胞培养箱，美国Thermo Fisher Scientific公司；Spectra MaxGemini酶标仪，美国Molecular Device公司；Sigma1-13高速台式离心机，德国Sigma公司；TS100 Nikon倒置相差显微镜、Ti-E活细胞工作站显微镜，日本Nikon公司；Bio-RAD 525电泳仪，美国Bio-RAD公司；凝胶成像分析系统，上海勤翔科学仪器公司；Clark氧电极，英国Hansatech公司。

1.4 MTT法检测细胞活性用胰蛋白酶消化对数生长期的细胞并计数，然后接种于96孔培养板中，密度为4×107L-1，每孔100 μL。待细胞贴壁达到80%后，用不同浓度的Andro(5、10、20、40、80 μmol·L-1)处理细胞24 h，去上清，每孔加100 μL D-Hanks稀释的MTT(1 g·L-1)，继续在孵箱中培养4 h，去上清，每孔加100 μL DMSO，摇床上摇至沉淀溶解，用酶标仪在570 nm处检测吸光值，计算细胞活性。

存活细胞/%=实验组吸光度值/对照组吸光度值×100%。

1.5 小鼠荷瘤模型的构建及给药常规方法培养4T1细胞至对数生长期，调整细胞密度为1×1010L-1，于小鼠第四乳房垫接种细胞悬液0.125 mL；接种后，每天观察小鼠状态及接种部位生长情况，肿瘤出现即为建模成功。将24只建模成功的小鼠随机分为4组，即Control组、5-Fu(20 mg·kg-1)组、Andro 5 mg·kg-1组、Andro 10 mg·kg-1组，每组6只。腹腔注射给药，Control组及Andro治疗组每天1次；5-Fu组前6 d每天1次，之后每2天1次，共给药10 d。

最后1 d小鼠称重后，眼球取血(血样行1.8检测乳酸含量)，颈椎脱臼处死小鼠，剖取肿瘤、肝脏、脾脏、胸腺(脏器行1.6测定抑瘤率及脏器指数)，肿瘤组织冻存于-80℃。

1.6 抑瘤率及脏器指数测定各组小鼠肿瘤、肝脏、脾脏、胸腺称重，计算抑瘤率、脏器指数。

抑瘤率/%=(Control组平均瘤重-处理组平均瘤质量)/Control组平均瘤质量 × 100%。

脏器指数/%=脏器质量/小鼠体质量 × 100%。

1.7 HE染色分析肿瘤形态学组织切片脱蜡，依次放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、无水乙醇Ⅰ 5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、75%酒精5 min后自来水冲洗；然后放入苏木精染液染3～5 min、自来水洗、分化液分化、自来水洗、返蓝液返蓝、流水冲洗；接着放入85%、95%梯度酒精各脱水5 min，放入伊红染液中染色5 min；最后放入无水乙醇Ⅰ 5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、无水乙醇Ⅲ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min后中性树胶封片。

1.8 乳酸(LD)测试盒检测小鼠血清中乳酸含量血样离心(3 000×g，10 min)取上清，按照乳酸(LD)测试盒测定乳酸含量；乳酸(LD)含量=(测定A值-空白A值)/(标准A值-空白A值) × 标准品浓度 × 样品测试前稀释浓度。

1.9 乙酰辅酶A检测试剂盒检测肿瘤组织内乙酰辅酶A的水平取-80 ℃冻存的肿瘤组织约50 mg，冰上充分匀浆，离心(2 000×g，20 min)取上清，按照乙酰辅酶A检测试剂盒测定乙酰辅酶A含量。

根据标准曲线计算样品乙酰辅酶A含量。

1.10 ATP检测试剂盒检测肿瘤组织中ATP含量取-80 ℃冻存的肿瘤组织约200 mg，加入2 mL裂解液，冰上充分匀浆，离心(12 000×g，5 min)取上清，按照ATP检测试剂盒测定ATP含量。通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。

相对ATP含量=ATP含量/蛋白浓度。

1.11 Western blot检测组织中PDH蛋白表达取-80 ℃冻存的肿瘤组织约50 mg，加入RIPA裂解液500 μL，冰上匀浆，4 ℃裂解30 min，离心(12 000×g，10 min)取上清，即为肿瘤组织总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液制备蛋白样品，100 ℃煮沸5 min变性处理。12.5%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电转移至PVDF膜上；5%脱脂奶粉室温封闭1 h；4 ℃一抗(PDH 1 ∶5 000；β-actin 1 ∶1 000)孵育过夜；室温鼠二抗(1 ∶1 000)孵育1 h；ECL显色，化学发光成像系统成像拍照，ImageJ软件用于灰度分析。

1.12 Clark氧电极检测细胞耗氧量用胰酶消化4T1细胞并计数，以5×107L-1的密度接种于6孔板中，每孔2 mL。以1/4 IC50、1/2 IC50、IC50浓度的Andro作用于细胞24 h后，吸掉培养基，收集细胞，用氧电极检测每组细胞的耗氧率[nmol/(mL·min)]。对每组细胞计数，根据耗氧率及细胞数量计算每组细胞的耗氧率[nmol/(mL·min·104cells)]。

1.13 JC-1染色检测线粒体膜电位用胰酶消化4T1细胞并计数，以5×107L-1的密度接种于24孔板中，以1/4 IC50、1/2 IC50、IC50浓度的Andro作用于细胞24 h后，吸掉培养基，加入JC-1染料(5 mg·L-1)，在37 ℃培养箱中孵育细胞30 min，PBS洗两次。倒置荧光显微镜观察线粒体膜电位变化。

2 结果

2.1 穿心莲内酯剂量依赖性抑制4T1细胞的增殖用不同浓度的Andro处理4T1细胞24 h，倒置相差显微镜观察细胞生长情况，如Fig 1A所示，随着Andro剂量增加，细胞皱缩变圆，细胞数量明显减少；MTT法检测细胞活性并计算IC50，如Fig 1B所示，Andro可剂量依赖性抑制4T1细胞增殖，其IC50值为40 μmol·L-1。

2.2 穿心莲内酯对4T1荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用将小鼠处死后取瘤观察，其实体瘤形态如Fig 2A所示，Andro 5、10 mg·kg-1组瘤体体积与Control组相比均降低，但没有5-Fu组抑制明显。各组平均瘤质量如Fig 2B所示，Andro 5、10 mg·kg-1组小鼠瘤质量明显降低(P<0.05)，抑瘤率分别为21.79%、35.89%，而5-Fu作为阳性药，抑瘤率为57.69%，与Andro给药组差异存在显著性。HE染色分析肿瘤形态结构，如Fig 2C所示，与Control组相比，Andro 5、10 mg·kg-1组及5-Fu组肿瘤组织细胞呈现不同程度皱缩、数量减少、间隙增大以及片状坏死等明显的病理性形态结构改变。

2.3 穿心莲内酯对荷瘤小鼠脏器指数及体重的影响为检测Andro对小鼠免疫、代谢器官的影响，比较了各组小鼠胸腺、脾脏及肝脏的差异。如Fig 3A、B、C所示，Andro 5、10 mg·kg-1组小鼠胸腺、脾脏、肝脏指数与Control组相比无差异，5-Fu组小鼠胸腺、脾脏指数明显降低(P均<0.01)。给药期间荷瘤小鼠的体重变化如Fig 3D所示，Andro 5、10 mg·kg-1组小鼠体质量与Control组相比差异均无显著性，而5-Fu组小鼠体质量前6 d增加平缓，从d 7开始出现明显的差异性，并出现摄食减少、死亡等现象。以上结果表明，Andro具有肿瘤抑制作用且毒副作用较小，对正常器官无明显损伤。

Fig 1 Proliferation of 4T1 cells inhibited by Andro n=3)

Fig 2 The inhibitory effect of Andro on solid tumors in mice n=5)

Fig 3 Effects of Andro on organ index and body weight of mice n=5)

2.4 穿心莲内酯抑制荷瘤小鼠肿瘤生长的可能机制

2.4.1穿心莲内酯对荷瘤小鼠能量代谢方式的影响 将小鼠处死后，收集各组小鼠血清，乳酸检测试剂盒检测乳酸含量，如Fig 4A所示，与Control组相比，Andro 5 mg·kg-1组小鼠血清乳酸含量明显降低(P<0.05)，随着Andro给药剂量的增加，血清中乳酸含量由48.5%下降至10.8%，表明Andro可抑制荷瘤小鼠糖酵解水平；同时检测了有氧呼吸部分指标，如Fig 4B所示，与Control组相比，Andro可剂量依赖性增加肿瘤组织中乙酰辅酶A含量(P<0.05，P<0.01)，如Fig 4C所示，Andro可上调肿瘤组织中丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)蛋白表达，如Fig 4D所示，Andro可剂量依赖性增加肿瘤组织中ATP含量(P均<0.05)，表明Andro可恢复线粒体氧化磷酸化。以上结果表明，Andro可抑制荷瘤小鼠糖酵解水平，恢复线粒体氧化磷酸化。

2.4.2穿心莲内酯对4T1细胞线粒体功能的影响 不同浓度的Andro处理4T1细胞24 h，Clark氧电极检测细胞中线粒体氧消耗，如Fig 5A所示，随着剂量增加，4T1细胞的耗氧量增加，说明Andro能够恢复线粒体耗氧，进而恢复线粒体氧化供能。之后，Andro预处理的4T1细胞经JC-1染色，荧光倒置显微镜观察细胞红绿荧光的变化，如Fig 5B所示，随着Andro浓度的升高，红色荧光逐渐增强，绿色荧光逐渐减弱，叠加之后荧光颜色由绿色逐渐变为橙色，表明线粒体膜电位升高。Andro作用于4T1细胞使其耗氧量增加、线粒体膜电位升高，表明线粒体功能有所改善。上述结果说明，Andro的抑瘤作用可能与改善线粒体功能有关。

3 讨论

穿心莲(andrographis paniculata)是一种在印度、中国和其他东南亚国家/地区传统医学中被广泛应用的草药，其主要用于治疗感冒、发烧、喉炎和多种传染病。穿心莲内酯作为穿心莲的主要药效成分，其抗癌活性受到越来越多的关注，有研究表明，Andro与卡铂联用可增加Hep-2人喉癌细胞对卡铂的敏感性[6]，Andro可在体外抑制结肠癌细胞SW-480、胃癌细胞SGC7901等多种肿瘤细胞增殖[7-8]。本研究发现，Andro可在离体水平抑制小鼠乳腺癌细胞4T1细胞增殖，在体水平抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，且对小鼠的生长及免疫器官(胸腺、脾脏)、代谢器官(肝脏)指数无明显影响，与阳性药物5-Fu组小鼠相比，虽然高剂量Andro的抑瘤率降低了22%左右，但未见5-Fu组所出现的毒副作用。

Fig 4 Energy metabolism regulated by Andro in breast cancer n=3)

Fig 5 O2 consumption and membrane potential of mitochondria upregulated by Andro in breast cancer cells n=3)

本研究发现，Andro可剂量依赖性地下调乳腺癌荷瘤小鼠血清中乳酸含量，提示，Andro对乳腺癌荷瘤小鼠的抑制作用可能与抑制糖酵解水平有关。肿瘤的发生依赖于细胞代谢的重新编程，这是致癌突变的结果。已知线粒体氧化磷酸化向糖酵解的偏移是大多数肿瘤具有的能量代谢变化[9]。糖酵解可以为肿瘤细胞提供代谢中间产物，同时产生乳酸，而乳酸的过度累积会加剧肿瘤微环境的形成，进而促进肿瘤的发生发展、侵袭转移[10]。Cai等[11]研究表明，乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A)的敲除可降低乳酸含量，抑制口腔鳞癌细胞增殖、转移和侵袭，达到降低其恶性程度的目的。另外，糖酵解途径中其他关键酶，例如丙酮酸激酶同工酶2、己糖激酶2的下调或敲除，亦可发挥抗肿瘤作用[12-13]。上述研究表明，糖酵解水平增强是肿瘤细胞的恶性特征之一，抑制糖酵解水平可发挥抗癌作用。

本研究发现，Andro可提高肿瘤组织中ATP含量，同时上调肿瘤组织中乙酰辅酶A含量、PDH蛋白表达，并可增加4T1细胞线粒体耗氧，表明Andro在抑制糖酵解水平时，对线粒体氧化磷酸化能力有一定的恢复作用，可促进肿瘤细胞氧化供能。同时Andro可升高4T1细胞线粒体膜电位，改善线粒体功能。Kaplon等[14]也提出，可通过调节PDH的负调节因子丙酮酸脱氢酶激酶1的异位表达或RNAi介导的PDH磷酸酶PDP2的缺失，使PDH活性减弱，诱发肿瘤产生。Stepp等[15]提出，敲除N-乙酰转移酶1基因表达可提高乙酰辅酶A水平，抑制乳腺癌细胞增殖、转移侵袭，降低其恶性程度。另一方面，线粒体功能障碍被认为与肿瘤的恶性程度密切相关，对肿瘤细胞线粒体的状态研究表明，肿瘤细胞具有功能性线粒体，并保留进行氧化磷酸化的能力[9]。庞皓玥等[16]提出，川芎嗪联合顺铂可减轻线粒体损伤，升高线粒体膜电位，改善线粒体功能，抑制肺癌A549细胞增殖及侵袭。

综上所述，Andro对乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤生长具有明显的抑制作用，且对免疫器官及代谢器官无显著影响。进一步探索其机制发现，Andro可能是通过抑制糖酵解水平，恢复氧化磷酸化，改善线粒体功能来发挥其抗癌作用，表明调整乳腺癌细胞能量代谢途径可能成为肿瘤治疗的新策略。