海昆肾喜胶囊通过激活自噬改善SAMP8小鼠认知功能障碍

张 松，王振国，陈宇航，兰江纯，何 珊,，张秀云

(山东中医药大学1.药学院；2.中医药经典理论教育部重点实验室，山东 济南 250355)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年性痴呆中发病率最高的一种神经系统性疾病，临床上以记忆衰退、学习及认知障碍为特征，主要的临床病理学标志为脑内β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein, Aβ)异常积聚以及细胞内Tau蛋白过度磷酸化[1]。研究显示，AD发病机制复杂，多与脑内异常蛋白质积聚有关，特别是Aβ的过度产生及清除不足是关键诱因，促进其清除或是防治此症的重要策略[2]。而自噬作为细胞内错误折叠蛋白质清除的关键途径，在神经系统疾病发病中作用显著[3]。

AD属中医“呆病”、“健忘”、“善忘”等范畴，近代中医多倾向从“肾虚”论治。随着研究深入，发现“毒损脑络”、“浊毒损脑”也是AD的重要病机[4]。而过度沉积的Aβ和过度磷酸化的Tau蛋白，是机体肾精亏虚、脏腑功能紊乱产生的痰浊瘀血，直接损伤脑髓，属“内生浊毒”范畴[4-5]。而自噬可降解过量沉积的蛋白，清除痰浊瘀血[5]，对于神经细胞内Aβ等的清除及减轻其毒性发挥重要作用[3]。所以，自噬通路为化浊/祛瘀中药防治AD的研究提供了新的思路。

海昆肾喜(HKSX)胶囊主要成分为中药昆布中提取的褐藻糖胶，是由α-L-岩藻糖-4-硫酸酯形成的水溶性杂多糖，有化浊、排毒之效。临床上用于慢性肾功能衰竭湿浊证[6]。此外，研究发现HKSX可以改善AD模型小鼠空间学习记忆障碍，提高脑内乙酰胆碱含量[7]，但具体机制尚不清楚。

HKSX化浊排毒，其对AD的干预作用是否与自噬相关？因此，本实验采用近交系快速老化P8(senescence-accelerated mouse prone 8，SAMP8)小鼠模拟人类衰老导致的学习记忆障碍，探讨HKSX是否通过调节自噬实现其对AD的干预作用，为其防治AD的临床应用提供科学依据，并为其他化浊/化瘀类中药防治AD的作用机制研究提供思路。

1 材料

1.1 实验动物16周龄雄性SAMP8小鼠48只，同周龄雄性抗快速老化小鼠1(senescence-accelerated mouse/resistance 1，SAMR1)小鼠16只，均为SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于山东中医药大学实验动物中心屏障设施，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0010。

1.2 实验主要试剂HKSX胶囊(吉林省辉南长龙生化药业股份有限公司， 015200507)，Aβ1-40ELISA试剂盒(酶联生物，m1001859)，Aβ1-42ELISA试剂盒(酶联生物，m1002201)，Radio Immunoprecipitation Assay(RIPA)裂解液(碧云天生物，P0013B)，BCA蛋白定量/浓度测定试剂盒(500 T)(美仑生物,MA0082-1)，PAGE凝胶超快速制备试剂盒10%(美仑生物,MA0382)，10X蛋白电泳缓冲液(美仑生物，PK10002)，PVDF膜(0.22 μm)(Merck Millipore，ISEQ00010)，10X电泳转移缓冲液(索莱宝，D1060)，TBST缓冲液(美仑生物，T1081)，兔抗Beclin-1(Cell Signaling TECHNOLOGY，3495)、兔抗LC3B(Cell Signaling TECHNOLOGY，2775)、兔抗SQSTM1/p62(Cell Signaling TECHNOLOGY，5114)、兔抗Syn(Cell Signaling TECHNOLOGY，4329)、兔抗PSD95(Cell Signaling TECHNOLOGY，2507)、兔抗β-Actin(Cell Signaling TECHNOLOGY,4967)，兔抗GAPDH(proteintech，10494-1-AP)，Western一抗稀释液(碧云天生物，P0023A)，山羊抗兔IgG/辣根酶标记(中杉金桥,ZB-2301)，灵敏ECL化学发光试剂盒(proteintech，PK10002)，甲醇(天津富宇，JC-01)

1.3 实验主要仪器医用离心机(湖南平凡科技有限公司，TGL-16A)，XR-SuperMaze动物行为分析系统、Morris水迷宫实验系统、物体识别实验系统(包括相同、不同物体)均为上海欣软信息科技有限公司，新物体识别箱-小鼠(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，63040)，酶标仪(赛默飞，MultiskanSky)，微孔板恒温振荡器(杭州佑宁仪器有限公司，WZ80-2)，凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司，Tanon 4800Multi)。

2 方法

2.1 动物分组及给药将16 周龄SAMP8小鼠[8]随机分成模型组(P8组)、HKSX低剂量组(L-HKSX组)、HKSX高剂量组(H-HKSX组)3组，同周龄SAMR1小鼠作为正常对照组(R1组)，每组16只。其中，HKSX低、高剂量组分别给予100、200 mg·kg-1·d-1(以其有效成分FPS的量计算，以人与小鼠的等效剂量比折算得到低剂量给药量，上调一倍得到高剂量给药剂量，给药时都以超纯水为溶媒)，R1组和P8组代之以同等体积的超纯水灌胃，每日1次，连续给药60 d(HKSX说明书中的一个疗程)，之后进行行为学检测。

2.2 行为学检测

2.2.1新物体识别(New Object Recognition，NOR)实验 首先进行NOR实验，实验历时3 d。d 1：将小鼠放入40 cm×40 cm的旷场中自由探索5 min；d 2：使小鼠熟悉大小、颜色、形状相同的两物体5 min；d 3：换入一大小、颜色、形状均不同的物体，再让小鼠熟悉5 min，并记录小鼠对两物体的探索时间[9]。实验全程由视频分析系统跟踪分析。每次实验结束后，用75%乙醇溶液擦拭测试箱和物体，防止气味干扰。结果用新物体识别指数(discriminition index)，即小鼠探究新物体所用时间占其探究两物体所用时间和的比例表示。

2.2.2Morris水迷宫(Morris Water Maze，MWM)实验 NOR实验结束d 2进行MWM实验。Morris水迷宫主要由圆形水池(直径90 cm，高50 cm)、水下平台(直径9 cm，高35 cm)以及图像采集分析系统SuperMaze组成，平台放置于第四象限。测试时，水深36 cm，水温为(22±2)℃，SuperMaze系统全程跟踪记录。实验前1 d，让小鼠自由游泳120 s，以便适应游泳环境。实验中为减少对动物行为的影响，尽量保持水温及外界环境稳定，SuperMaze系统全程跟踪记录。实验方法参考以往实验[10]。

(1)定位航行(acquisition trail)实验 实验共计6 d。每天以四个不同象限作入水点，将小鼠头部面向池壁放入水中，小鼠找到隐藏平台需要的时间记录为逃避潜伏期(escape latency，EL)。如果在60 s内没有找到平台，则将小鼠引至平台停15 s，以形成记忆，同时记录逃避潜伏期为60 s。

(2)空间探索(probe trial)实验 d 7撤去平台，将小鼠从目标象限的对侧象限(第二象限)以相同方法放入，记录60 s内小鼠的游泳轨迹，分析其在目标象限的游泳时间和穿越平台的次数。

2.3 标本采集行为学实验结束后，小鼠断头，将海马组织剥离出，稍吸干后称重，置于-80 ℃冰箱保存，待测各项指标。

2.4 ELISA法测海马组织中Aβ1-40和Aβ1-42的表达取2.3项下各组组织，按说明书操作提取总蛋白，BCA法定量蛋白浓度并调至同一浓度水平；按说明书操作设置标准孔、样品孔和空白孔，分别加入相应试剂；封板膜封板，37 ℃温育60 min；再经洗涤、加显色液、避光孵育、加终止液等步骤，最后在450 nm波长下检测各孔吸光度，根据标准曲线，算出组织中Aβ1-40和Aβ1-42的表达[11]。

2.5 Western blot检测方法参考以往实验[12]，取2.3项下各组组织，按说明书操作提取总蛋白，BCA法定量各组蛋白浓度并调至同一水平；SDS-PAGE电泳分离，每孔上样10 μL；转膜；5%脱脂奶粉封闭2 h；一抗(p62，1 ∶1 500；LC3B，1 ∶1 500；Beclin-1，1 ∶1 500；PSD95，1 ∶1 500；Syn，1 ∶1 500；β-actin，1 ∶2 500；GAPDH，1 ∶6 750)4 ℃过夜孵育；二抗室温孵育1 h；ECL化学发光成像，Image J软件分析蛋白表达量。

3 结果

3.1 HKSX胶囊改善SAMP8小鼠学习、记忆能力

3.1.1NOR实验 NOR测试是一种敏感的认知能力测定，如果实验动物在d 2 已经对两个相同物体形成记忆，那么在d 3的识别阶段，它们将花费更多时间来探索新物体[9]。如Fig 1所示，NOR实验中，与R1小鼠相比，P8组小鼠明显降低对新物体的辨别力(P<0.01)；给药后，低、高剂量组小鼠对新物体的识别指数均有所增加(P<0.05，P<0.01)，由此可见，HKSX能提高AD小鼠对新物体的分辨能力和识别率，改善其学习、记忆障碍。

3.1.2HKSX胶囊改善小鼠定位航行和空间探索能力 如Fig 2A、B所示，在定位航行实验中，AD模型组小鼠寻找逃避平台的时间最长，且随训练天数的延长无明显改善，说明SAMP8小鼠的学习记忆能力较差；而正常组小鼠训练过程中逃避潜伏期明显缩短，提示其学习适应能力较强。给药组小鼠寻找平台所需的逃避潜伏期明显降低，说明HKSX可以明显改善SAMP8小鼠的学习能力，且以高剂量组效果更佳。

分析图2C-E，与R1组相较，P8组小鼠在目标象限的停留时间和穿越平台的次数明显偏少(P<0.01)，说明AD小鼠的确存在记忆障碍；而与模型组相比，HKSX高、低剂量都能改善这一现象，即HKSX很大程度上提高SAMP8小鼠的学习、记忆及记忆再提取的能力，且高剂量组的改善效果更好(P<0.01)。

3.2 HKSX胶囊降低SAMP8小鼠海马组织中Aβ1-40和Aβ1-42水平ELISA实验显示(Fig 3)，与R1组相比，P8组小鼠脑内Aβ1-40和Aβ1-42水平均有大幅度增多(P<0.01)，而L-HKSX组和H-HKSX

Fig 1 Effect of HKSX on memory ability of SAMP8 mice in NOR Test n=16)

Fig 2 HKSX improved learning and memory function of SAMP8 mice in MWM test n=16)

Fig 3 Effect of HKSX on level of Aβ1-40 and Aβ1-42 in SAMP8 mice n=8)

组小鼠脑内Aβ1-40和Aβ1-42水平较于P8组均明显降低(P<0.01，P<0.05)，尤其H-HKSX的清除效果更明显。说明HKSX可清除Aβ在脑组织中的过度沉积，降低其带来的神经毒性损伤，进而对AD起到防治效果。

3.3 HKSX胶囊调节自噬相关蛋白表达，激活自噬如Fig 4所示，与R1组相比，P8组小鼠海马组织p62蛋白表达明显偏多(P<0.01)，而LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达量明显减少(P<0.01)。这一相对

Fig 4 Effect of HKSX on expression of autophagy-related proteins in SAMP8 mice n=8)

表达趋势说明模型组小鼠自噬功能受到损害。HKSX给药后，LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达明显提升，同时下调p62水平，提示HKSX低、高剂量可不同程度激活自噬，改善自噬功能障碍，增强异常蛋白的清除，其以高剂量效果更明显(P<0.01)。

3.4 HKSX胶囊提高突触可塑性WB结果显示(Fig 5)，相较于R1组，P8组小鼠脑内Syn、PSD95水平明显降低(P<0.01)，表明P8组小鼠的突触传导受到阻滞，印证了AD确实可导致小鼠学习记忆能力障碍；与P8组相比，低、高剂量HKSX均能上调Syn、PSD95在海马组织中的表达(P<0.05，P<0.01)，增加神经突触可塑性，增强突触传导，最终达到干预AD的目的。

Fig 5 Effect of HKSX on expression of synaptic plasticity-related proteins in SAMP8 mice n=8)

4 讨论

自噬是真核细胞中发生的一种自我降解的过程，可以吞噬损伤的细胞器、错误折叠的蛋白等废物，供给细胞重新利用或排出体外，从而维持细胞结构和功能、延缓衰老[5]。研究表明，随着机体衰老，自噬水平明显下降[13]。而上调自噬功能，Aβ蛋白的异常聚集及其导致的神经元死亡都能够表现出减缓的现象[14-15]。因此，激活自噬的发生为AD治疗提供了新的视角。

细胞自噬受多条信号通路调节，其中Beclin-1、LC3和p62是参与自噬的重要蛋白[3,14]。Beclin-1参与自噬起始阶段，可形成Beclin1-Vps34-Vps15复合结构而启动自噬、促进吞噬泡成核并召募蛋白形成自噬前体[14]。LC3能被Atg4激活成LC3-Ⅰ，并与磷脂酰乙醇胺连接成复合物，参与调控自噬体扩散和延展过程[3]。p62与泛素化蛋白和LC3-Ⅱ结合成复合体，启动自噬体形成，而自身则会连接异常致病蛋白一同被自噬溶酶体降解[16]。研究表明，自噬相关蛋白Beclin-1在AD患者脑中减少，p62含量增加，LC3-Ⅱ水平与AD样本的Aβ斑块密切相关，载满未消化Aβ等底物的自噬结构则验证了AD小鼠确实存在自噬受损的情况[14]。

HKSX的成分为中药昆布中提取的褐藻糖胶，为昆布的主要活性成分。《本草纲目》记载，昆布性寒，咸，归经于肝，胃，肾经，有消毒解痰，软坚散结，利尿活水、化瘀消肿等重要功效，用于治疗瘿瘤，瘰疬，睾丸肿痛，痰饮水肿等病症。所以，从中医中药学分析，HKSX善利水化痰，适用于癥瘕痰瘀胶结之证。如前所述，自噬功能障碍可能是AD“浊毒损脑”发病的微观机制，细胞自噬则是消除内生痰浊瘀血的重要机制[5]，而HKSX可以化浊排毒，所以推测HKSX可以通过激活自噬，改善AD认知障碍。

药效学实验表明，HKSX可提高SAMP8小鼠对新颖物体的识别指数，且明显缩短水迷宫实验中小鼠的逃避潜伏期，增加其在目标象限停留时间和穿越平台的次数，ELISA结果显示脑内Aβ水平减少。这表明，HKSX可以化浊排毒，促进Aβ的降解，从而改善记忆，那么其作用机制是否与自噬有关？Wenstern btot研究结果表明，自噬相关基因Beclin-1、LC3-Ⅱ在SAMP8小鼠中表达下降，而p62表达水平上升，说明AD小鼠的自噬功能的确是损伤的；而HKSX治疗能调节上调Beclin-1、LC3-Ⅱ表达，下调p62水平，以激活自噬。

此外，Syn和PSD95主要调节神经元突触的形成和突触可塑性改变，研究表明Syn和PSD95含量下降现象存在于AD模型小鼠的大脑海马组织中[17]。我们同样发现SAMP8小鼠海马组织中Syn和PSD95蛋白表达下调，表明在SAMP8小鼠中神经元突触形成及功能障碍。而HKSX给药后，蛋白Syn和PSD95表达量增多，表明HKSX可以促进突触结构的重建，改善突触传导和神经信息的传递。

总之，本文结果表明HKSX胶囊可以上调自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ，同时下调p62含量，改善自噬功能障碍，进而减少脑内Aβ的异常集聚，减轻神经毒性作用；并且提高了PSD95和Syn蛋白的表达量，提高神经元的突触可塑性，进而改善SAMP8小鼠的学习和记忆障碍。关于HKSX胶囊如何调节自噬，目前的研究表明，多糖在肠道菌群的发酵下代谢产生短链脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)，而SCFAs在“肠-脑轴”相互作用中具有关键作用[18]，肠道内游离的SCFAs可以通过单羧酸转运蛋白穿过血脑屏障；此外，SCFAs还可以通过G蛋白偶联受体结合，进一步调节腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinas, AMPK)、核因子等信号通路，从而直接或间接影响脑功能[18]。而其中AMPK信号通路与自噬密切相关[14]，这些结果为我们下一步详细的机制研究提供了启示和思路。