周禹柠,徐培杰,邓楚凡,王璐莹,陶梦停,杨 勇,白 婷
(大连大学 慢性病研究中心大连市重点实验室,辽宁 大连 116622)
酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是长期饮酒引起的肝脏损害,是进展期肝脏疾病非常重要的原因之一。ALD疾病谱酒精性脂肪肝的发病率也逐渐增高,若得不到有效治疗可导致酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、肝硬化,对患者身体健康有着严重影响[1]。因此,探明ALD的发病机制,以期为探索有效的ALD治疗靶点提供坚实的理论依据尤为重要。白杨素(chrysin,CHR)是广泛存在于蜂蜜、蔬菜、水果中的天然黄酮类化合物,具有抗氧化、抗炎、抗癌的活性[2]。该研究采用小鼠Lieber-DeCarli酒精液体饲料联合单剂酒精灌胃模型,探讨白杨素对酒精性肝损伤中SIRT1/AMPK信号通路的调控作用。
1.1 实验动物C57BL/6小鼠,♂,体质量(20±2)g,购自辽宁长生生物技术股份有限公司,SCXK(辽)2020-0001。
1.2 药物与试剂白杨素(HY-14589)、SRT1720(SIRT1激动剂,HY-15145)、AICAR(AMPK激动剂,HY-13417)均购买于MCE上海皓元生物公司;Lieber-DeCarli酒精液体饲料(南通特洛菲公司);甘油三酯(TG)试剂盒(A110-1-1)、谷草转氨酶(AST)试剂盒(C010-2-1)、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒(C009-2-1)均购买于南京建成生物工程研究所;AMPKα抗体(cs-5831)、p-AMPKα抗体(cs-2535)、SIRT1抗体(cs-2028)、GAPDH抗体(cs-2118)均购买于CST公司。
2.1 动物分组48只C57BL/6小鼠随机分成6组:正常组、酒精模型组(EtOH)、SRT1720组(EtOH+SRT1720)、AICAR组(EtOH+AICAR)、CHR组(EtOH+CHR 25、50 mg·kg-1),每组8只。
2.2 造模及给药采用Gao-Binge模型方法建立小鼠酒精性肝病模型[3],应用Lieber-DeCarli的对照饮食适应性喂养5 d后,除正常组外,其余5组给予含5%酒精的Lieber-DeCarli液体饲料喂养。每天1次对CHR组进行不同浓度的CHR灌胃,SRT1720组50 mg·kg-1SRT1720灌胃,AICAR组500 mg·kg-1AICAR灌胃,持续喂养10 d。d 11对照组灌胃麦芽糖糊精,其余5组给予5 g·kg-1酒精灌胃,9 h后采用乙醚麻醉小鼠,眼球采血,取出肝脏左前叶用多聚甲醛固定,其余置-80 ℃冻存备用。
2.3 血清生化指标测定使用检测试剂盒测定AST、ALT、TG血清中含量。
2.4 肝组织病理及免疫组织化学检测肝组织病理切片,进行常规HE染色及SIRT1、p-AMPKα免疫组化染色,200倍光学显微镜下观察病理改变。
2.5 肝脏中蛋白表达检测取肝组织匀浆提取蛋白,采用Western blot检测SIRT1、AMPKα、p-AMPKα的表达水平。
3.1 CHR对小鼠血清中AST、ALT、TG含量的影响如Tab 1结果显示,与正常组相比,EtOH组小鼠血清中AST、ALT、TG含量明显升高(P<0.01),与EtOH组相比,CHR给药组呈剂量依赖性降低,SRT1720、AICAR组3者水平均明显降低(P<0.01),且CHR高剂量组要低于各激动剂组。
Tab 1 Comparison of serum AST, ALT, TG content in each group n=8)
3.2 CHR对小鼠肝组织病理变化的影响HE染色结果显示,EtOH组肝细胞肿胀,有脂肪空泡、炎性细胞浸润等病理损伤,CHR给药组随着浓度增加,肝组织病理变化明显减弱,SRT1720、AICAR组小鼠肝组织病理变化明显减轻。
3.3 CHR对小鼠肝脏SIRT1、AMPKα、P-AMPKα表达的影响免疫组化染色结果显示,正常组SIRT1、P-AMPKα细胞染色有大量黄色或棕黄色,EtOH模型组小鼠肝脏SIRT1、P-AMPKα表达明显减少。与EtOH组相比,CHR给药组、SRT1720及AICAR组的SIRT1、P-AMPKα表达明显增加。同时,采用Western blot检测SIRT1、AMPKα、P-AMPKα蛋白表达水平,与正常组比较,EtOH组SIRT1、AMPKα表达水平以及AMPKα的磷酸化水平明显减少(P<0.01),与EtOH组比较,CHR给药组以及SRT1720、AICAR组SIRT1、AMPKα表达水平以及AMPKα的磷酸化显著增加,且有一定的剂量依赖性(P<0.01)。
Gao-Binge模型模拟了慢性加急性酒精性肝损伤的患者病程,这种慢加急性协同作用导致小鼠脂肪变性、炎症和肝损伤[4-5]。本研究显示,小鼠酒精模型组的肝脏甘油三酯蓄积,脂肪空泡形成,炎性细胞浸润,表明成功建立Gao-Binge酒精性肝病模型,且CHR给药组的小鼠肝脏脂肪变性减轻,血清中转氨酶指标AST、ALT及TG含量明显降低,表明CHR能够改善酒精性肝损伤。
SIRT1/AMPK信号通路在酒精性肝损伤中起关键作用[6],本研究发现CHR能够增强SIRT1、AMPKα表达水平及AMPKα的磷酸化作用。综上所述,白杨素能够改善酒精性肝损伤进程,激活SIRT1/AMPK信号通路是其可能的分子机制。