参草通脉方对慢性心力衰竭大鼠心肌ANP、AngⅡ及肾组织cAMP、PKA 及PKC 含量的影响

礼 海 刘晓蕾 王 懿 张 艳

1.沈阳市第二中医医院医务科，辽宁沈阳 110101；2.辽宁中医药大学附属医院专家门诊，辽宁沈阳 110032

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）为多种心血管疾病的终末期综合征，随着循环系统疾病发病人数逐年增多，本病发病率逐年上升，有报道称我国每年城市发病率为3‰～5‰，多发于50 岁以上人群，随着年龄增加，发病率呈增高态势[1-2]。随着研究的深入，有研究发现CHF 与肾功能异常有着密切关系，心排血量不断减少，患者长期处于渐进性缺血缺氧状态，以致肾素血管紧张素系统处于持续激活状态，导致肾单位坏死，血管阻力不断增大，造成回心血量进一步减少，形成恶性循环[3-5]。本研究探讨参草通脉方对CHF 及其肾功能指标的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取SPF 级12 周龄，体重300～350 g 的雄性大鼠60 只，由辽宁中医药大学动物实验中心提供。许可证号：SCXK（辽）2015-0001，合格证号：201703120。本研究经辽宁中医药大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 仪器与试药

HD-1 小动物呼吸机（浙江医科大学医疗仪器实验厂）、MS-2000 多媒体化生物信号记录分析系统（广州市龙飞达科技有限公司）、SONO S5500 彩色多普勒超声机（Agilnet 公司）、小型离心机（美国Sigma 公司）。酶联免疫吸附试验试剂盒均由上海羽朵生物科技有限公司提供。

参草通脉复方（方药组成为黄芪、丹参、益母草、人参、红花、三七粉、葶苈子；配伍比例3∶2∶2∶1∶1∶1∶1，批号：辽药制Z0901013，辽宁中医药大学附属医院药剂制备中心生产）；福辛普利钠片（上海施贵宝制药有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物造模 60 只大鼠适应性喂养7 d 后，为全部动物编号，随机抽取正常组、假手术组各8 只。其余及假手术组禁食不禁水12 h 后，使用10%水合氯醛0.5 ml/100 g 腹腔麻醉，以气管插管术迅速连接小动物呼吸机（频率80 次/min，潮气量0.7 ml/kg），在左侧第三、四肋间横向切开长1～2 cm 开口，逐层钝性分离，暴露心脏，于左冠状动脉前降支起源点3～4 mm处缝线结扎（假手术组结扎5 s 后松开），心电监测示胸前导联ST 段及T 波显著异常，重置心脏于胸腔，分层缝合，开口处敷注射用青霉素钠待大鼠平稳后，口腔清痰，停呼吸机。术后72 h 内注射青霉素钠30 万U/次，1 次/d。术后常规喂养7 d，除正常组与假手术组外，第8 天将饲料减少1/3，游泳至其疲乏，1 次/d；减少饲料当天加用3%腺嘌呤食用油10 ml/kg，1 次/d，检测血清肌酐（serum creatinine，Scr），14 d 后检测Scr 上升至第8 天检测值的1.0～1.5 倍后，改为每3 天1 次，共28 d。当其左室射血分数≥60%，Scr≥初次检测的2 倍为达到造模标准[6-7]。

1.3.2 用药方案 造模成功大鼠按照体重大小依次编号，采用随机数字表求余数法将其分为中药组、模型组、西药组，每组8 只。正常组、假手术组、模型组常规灌胃蒸馏水1.5 ml/次，2 次/d；其余两组按人鼠剂量换算公式[剂量（g/kg）=给出的人的剂量（g）×0.018/所求动物体重（kg）]灌胃给药[7]。中药组给予参草通脉复方生药7.2 g/kg，2 次/d；西药组给药2 次/d，第一次为福辛普利1.2 mg/kg，第二次为蒸馏水1.5 ml。五组均干预28 d。

1.3.3 实验操作 用药28 d 后，禁食不禁水24 h，取大鼠心肌组织使用酶联免疫吸附试验测定心房利尿钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）含量。处死大鼠后取肾脏组织，在液氮下保存备用。检测时待标本在4～8℃下融化后，取等分后加入0.9%氯化钠匀浆充分后，3500 g 离心10 min，利用酶联免疫吸附试验测定各组肾脏组织环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）含量，操作方法按照试剂盒说明书进行。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组ANP、AngⅡ水平比较

模型组ANP、AngⅡ水平高于正常组、假手术组，中药组ANP、AngⅡ水平低于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 各组ANP、AngⅡ水平比较（ng/L，）

表1 各组ANP、AngⅡ水平比较（ng/L，）

注：与正常组比较，aP ＜0.05；与假手术组比较，bP ＜0.05；与模型组比较，cP ＜0.05。ANP：心房利尿钠肽；AngⅡ：血管紧张素Ⅱ

2.2 各组cAMP、PKA、PKC 水平比较

模型组cAMP、PKC 水平高于正常组、假手术组，PKA低于正常组、假手术组，中药组cAMP、PKC 水平低于模型组，PKA 高于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

表2 各组cAMP、PKA、PKC 水平比较（）

表2 各组cAMP、PKA、PKC 水平比较（）

注：与正常组比较，aP ＜0.05；与假手术组比较，bP ＜0.05；与模型组比较，cP ＜0.05。cAMP：环磷酸腺苷；PKA：蛋白激酶A；PKC：蛋白激酶C

3 讨论

3.1 观察指标在临床研究中的意义

参草通脉方采用心肾同治理论对CHF 模型大鼠进行干预，其中ANP 是一种多肽类激素，在心肌结构改变前期，因肾素-血管紧张素-醛固酮系统（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS）被激活，心肌细胞会加速合成ANP，抑制RAAS，增加排尿，扩张心血管，CHF 患者ANP 含量是正常人群5 倍以上[8]。而AngⅡ被认为是RAAS 中最重要的激素，其释放量与CHF严重程度一致。早期AngⅡ能促进回心血量及心排血量的增加，失代偿后血管平滑肌增厚，导致心肌纤维化及重构[9-10]，并持续兴奋交感神经，导致去甲肾上腺素加速释放，增加醛固酮分泌，引起水钠潴留，而水钠潴留是肾小球滤过率减少、肾小管对Na+重吸收增加的过程，因此导致肾脏损害[11]。

cAMP 具有良好的抗缺血与缺氧作用，在心肌细胞中通过加强磷酸化过程，促进兴奋收缩偶联，增加心输出量，扩张外周血管，降低心脏前后负荷，达到改善心功能的作用[12]。cAMP 在细胞内的传导依赖于PKA。在肾脏组织细胞内，cAMP 的抗氧化等作用通过PKA 的大量激活而实现，PKA 能够减少肾小球活性氧的生成，减少氧化应激反应，阻止肾脏内皮细胞凋亡，起到保护肾脏的作用[13]。而PKC 与PKA 共同参与磷酸化的过程，在其过程中抑制细胞生成素与DNA结合，达到阻止细胞分化，促进肌纤维化，影响肾脏功能[14-16]。

3.2 参草通脉方干预CHF 的药理研究

参草通脉方中黄芪多糖具有强心作用，黄芪皂苷甲可双向调节血压，可以有效增加肾脏血流[17-18]。小剂量益母草有显著的强心作用，在增加冠状动脉血流，保护受损心肌的同时，可改善肾血流动力学，增加肾血流量，有效治疗急、慢性肾衰竭引起的水肿[19-20]。人参具有强心及增强非特异性免疫的作用，而且能够显著抑制近曲小管上皮细胞增殖，抑制肾间质纤维化，延缓肾小球硬化，改善肾脏功能[21-23]。葶苈子中的葶苈苷有减慢心率的作用，能够增加肾小球滤过率，促进肾脏代谢，维护肾功能，全方合用强心而不增负，同时促进代谢，保护心、肾脏结构等功效[24-25]。

3.3 研究临床意义

本研究中，中药组心肌ANP、AngⅡ水平低于模型组，中药组肾脏组织PKA 水平高于模型组，PKC 水平低于模型组。推测参草通脉方能够有效抑制ANP、AngⅡ表达，延缓心肌重构，同时能够有效增加PKA，抑制PKC。PKA 表达的增加可促进细胞磷酸化，影响细胞代谢，抑制氧化作用。参草通脉方可促进PKA 的催化亚基释放，在cAMP 水平变化较小的情况下，加速酶活化，发挥保护心肾脏器的效能[26-30]。

综上，参草通脉方对心肾组织均有良好的保护作用，能够有效治疗CHF，综合调节机体，减少肾脏失代偿后给CHF 治疗带来的不利影响，提高患者生存质量。