基于网络药理学探究黄芪-党参药对治疗糖尿病肾病的作用机制

刘正平 曹 钋 钟 剑 魏 宇 王世东 史月欣

1.北京中医药大学第一临床医学院，北京 100700；2.北京中医药大学东直门医院肾病科，北京 100700

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常见的微血管并发症之一。研究显示，2019 年全球约4.63 亿成人患糖尿病，预计到2045 年将达到7 亿[1]。随着糖尿病患病率的增加，DN 患病人数也在逐年上升，并且DN 已经成为终末期肾病的主要原因[2]。但目前西医尚无阻止DN 进展的特效治疗方法。针对这一现状，中医药领域进行了大量的探索性研究，证实中医药可以通过改善肾循环、减少尿蛋白来延缓DN 进展[3]。中医学中一般将DN 归为“消瘅”“肾消”“水肿”等范畴[3]。DN 的病机为虚、瘀、浊，而虚为发病的基本条件。虚证又以气虚为核心，并见阳气、气血、气阴的亏虚，故治疗补虚以补气为首要任务[4]。黄芪-党参是临床上常用的补气药对，党参偏于阴而补中气，黄芪偏于阳而实卫表之气，二药相和，一表一里，一阴一阳，相辅相成，共奏补气扶正之效[5]。临床研究证实黄芪-党参药对配伍的复方治疗DN 能明显降低尿蛋白，具有很好的保护肾功能的作用[6]，但其治疗DN 的作用机制尚不明确。本研究通过网络药理学方法探索该药对治疗DN 的作用机制，为后续临床治疗及实验研究提供理论基础和研究思路。

1 资料与方法

1.1 黄芪-党参有效成分及作用靶点的收集

采用中药系统药理学数据库与分析平台检索黄芪、党参的化学成分，根据药代动力学参数，将口服生物利用度≥30%及类药性≥0.18 作为筛选条件，获取黄芪、党参药物有效成分，并收集相应的作用靶点。通过Uniprot 数据库将作用靶点转化为基因靶点。

1.2 药物有效成分-靶点网络构建

将基因靶点和有效成分导入Cytoscape 3.8.1 软件，构建药物有效成分-靶点的网络图。

1.3 DN 相关靶点的收集

通过检索词“diabeticnephropathy”，分别检索OMIM、DisGeNET、GeneCards 数据库收集相关靶点，合并去重后得到DN 的疾病靶点数据库。

1.4 蛋白-蛋白互作网络的构建

将基因靶点和疾病靶点导入Venny 2.1 平台，取交集后将其上传至STRING 11.0 数据库，构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。

1.5 基因本体（gene ontology，GO）及京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG）通路富集分析

将交集靶点上传至Metascape 数据库，进行GO及KEGG 通路富集分析。

2 结果

2.1 有效成分及作用靶点的收集

经过检索和筛选后共得到黄芪-党参药对有效成分34 个（表1），获得基因靶点221 个。

表1 黄芪-党参药对有效成分信息

2.2 药物有效成分-靶点网络图

利用Cytoscape 3.8.1 软件，构建了有257 个节点、638 条边的药物成分-靶点网络图，见图1。节点的度值越大，提示其在网络中的地位越重要。由此筛选出黄芪-党参重要有效成分包括槲皮素、山柰酚、木犀草素等。

图1 黄芪、党参有效成分-靶点图

2.3 PPI 网络构建

经检索和筛选获得1466 个疾病靶点，与基因靶点取交集获得100 个交集靶点。将其上传至STRING 11.0 平台构建PPI 网络，见图2。采用Cytoscape 软件计算PPI 网络节点的度值，取前15 个作为核心靶点，按度值大小排序依次为AKT1、TNF、IL-6、VEGFA、TP53、CASP3、MAPK1、JUN、MMP9、MAPK8、PTGS2、EGF、CCL2、CXCL8、EGFR。

图2 疾病-药物的蛋白质-蛋白质相互作用网络图

2.4 GO 及KEGG 分析结果

GO 分析结果显示：交集靶点涉及的生物过程有凋亡信号通路、活性氧代谢过程、细胞对生长因子刺激等；根据P 值大小取前20 作图，见图3。KEGG 分析结果显示：交集靶点涉及的通路主要有AGE-RAGE、IL-17、MAPK、NF-κB、VEGF、JAK-STAT等信号通路。借助imageGP 在线作图工具，根据P 值大小取前20 绘制气泡图，见图4（封三）。

图3 黄芪-党参药对作用于糖尿病肾病靶点的基因本体分析

图4 黄芪-党参药对作用于糖尿病肾病靶点的京都基因和基因组数据库分析（见内文第122 页）

3 讨论

DN 早期病理主要表现为肾小球滤过率增加、肾小球系膜区增宽和肾小球毛细血管基膜增厚，后期表现为肾小球滤过率下降，肾小球、肾小管间质纤维化[7]。而DN 的发病机制极其复杂，目前认为与遗传因素、代谢机制紊乱、血流动力学改变、炎症反应、氧化应激等相关[7-8]。

本研究筛选出黄芪-党参药对重要的有效成分是槲皮素、山柰酚、木犀草素等。槲皮素、山柰酚、木犀草素均具有抗炎、抗氧化、保护肾脏的作用[9-11]。研究表明，槲皮素可以通过激活海马通路抑制肾小球系膜细胞增殖[12]、拮抗转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β1的活性来对抗肾小球基底膜增厚[13]，从而保护肾功能。山柰酚可以通过抑制RhoA/Rho 激活[14]、抑制TGF-β1诱导的大鼠肾小管细胞的上皮-间质转化过程，改善肾损伤和纤维化。Zhang 等[15]认为木犀草素可以通过抑制STAT3 通路激活来抑制炎症反应和氧化应激，从而减少肾纤维化，延缓DN 进展。

通过PPI网络预测AKT1、IL-6、TNF等为治疗DN 的核心靶点。AKT 可在人体组织中广泛表达。石明隽等[16]研究发现，AKT 可能通过TGF-β1激活PI3K/AKT 信号通路，促使细胞增殖、分化，加重肾脏肥大和细胞外基质沉积，促进肾小管间质纤维化。IL-6、TNF是目前研究最广泛的参与DN 炎症机制的细胞因子[17-19]。IL-6 可以通过与系膜细胞受体结合刺激肾小球系膜增殖，改变肾小球系膜结构[20]；还能通过激活JAK2/STAT3 通路促使肾脏足突细胞肥大[21]，多途径造成DN 的发生、发展。张国艳等[22]认为TNF-α 可以直接诱导肾脏细胞产生活性氧，导致肾小球血管壁的改变，从而增加白蛋白的通透性，产生蛋白尿。由PPI网络结果显示的核心靶点涉及炎症反应、氧化应激反应、细胞凋亡等方面，直接或间接作用于肾小球系膜细胞、足突细胞、细胞外基质及肾小管等部位，从而参与DN 的发生、发展。

在KEGG 分析结果中，黄芪-党参药对治疗DN相关通路主要有AGE-RAGE、IL-17、MAPK、NF-κB、VEGF 等信号通路。研究显示，AGEs 与其受体RAGE结合后，可以通过增加细胞因子的释放和细胞外基质的产生，进而导致肾小球肥大、硬化[23]。此外，AGERAGE 信号通路的激活引起细胞内多种通路的激活，如PI3K/AKT、p38MAPK、VEGF 等信号通路[24-25]。IL-17 信号通路、MAPK 信号通路、NF-κB 信号通路均为重要的炎症信号通路，能增加TNF-α、IL-6、TGF-β1 等促炎性细胞因子的产生，加重体内炎症反应，从而加快DN 的发生及发展[26]。由此可以推测，黄芪-党参药对通过多条通路抑制肾脏细胞异常增殖、减轻体内免疫炎症反应来治疗DN。

本研究结果显示，黄芪-党参的主要有效成分为槲皮素、山柰酚、木犀草素等，核心作用靶点以AKT1、IL-6、TNF、VEGFA 等为主，并通过调节AGE-RAGE、IL-17、MAPK、NF-κB、VEGF、JAK-STAT 等信号通路发挥治疗DN 的作用。