特异性坏死性凋亡抑制剂-1(Nec-1)减轻脊髓损伤模型大鼠胶质瘢痕的形成

陈 胜，王春明，严雪飞，毛渊青

(南京医科大学附属江苏盛泽医院/南京医科大学康达学院盛泽临床医学院 骨科， 江苏 苏州 215228)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)可导致机体运动功能和感觉功能丧失，甚至造成死亡，对患者造成极大危害[1]。胶质瘢痕是脊髓损伤后，由星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质前体细胞形成的一种边界结构，在脊髓损伤后期阻碍神经元轴突的延伸和神经轴索的再生，抑制神经功能恢复。因此，抑制胶质瘢痕的形成，对脊髓损伤的恢复有重要意义。脊髓损伤后细胞会发生程序性死亡，细胞凋亡及自噬相关蛋白显著增加[2]。Cathepsin B是一种半胱氨酸蛋白水解酶，调节细胞死亡和细胞内蛋白质分解代谢。Caspase家族蛋白是细胞凋亡的重要参与者，在局灶性脑梗死中发现cathepsin B可调控caspase-3蛋白酶，扩大细胞凋亡[3]。减少星形胶质细胞的活化，可以抑制瘢痕的形成。特异性坏死性凋亡抑制剂-1(necroptosis inhibitor-1/necrostatin-1,Nec-1)是小分子碱类物质,是程序性坏死的特异性抑制剂，在细胞的死亡和炎性反应中发挥重要作用。本文观察Nec-1对脊髓损伤大鼠模型胶质瘢痕形成的影响，及其抑制瘢痕形成的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级SD雌性大鼠，体质量180～200 g{广州医科大学实验动物中心[许可证号：SYXK(粤)2016-0158]}。进行常规饲养，适应饲养1周后用于研究。本研究遵循《实验动物管理条例》。

1.1.2 主要试剂：Nec-1抗体、caspase-3抗体、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体和波形蛋白(vimentin)抗体(Abcam公司)；cathepsin B抗体(Bioss公司)；辣根过氧化物酶标记(HRP)的山羊抗兔二抗(北京博尔西科技有限公司)；BCA蛋白浓度检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：将大鼠随机分为假手术组、模型组(采用改良Allen的重物坠落法[4])和Nec-1组(在大鼠侧脑室注射10 μmol/L Nec-1溶液10 μL)，每组18只。

1.2.2 后肢运动评分及评价：用国际公认的Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)进行评分，并用双盲法评价大鼠后肢运动功能。

1.2.3 免疫荧光检测胶质瘢痕的形成：取各组小鼠伤段的脊髓组织，制作冰冻切片，在37 ℃进行封闭1 h，加入GFAP一抗(1∶200)于4 ℃过夜，PBS清洗，加二抗(1∶1 000)，室温孵育2 h，PBS清洗3次后封片，用荧光显微镜进行观察，用Image Pro Plus 6.0软件进行软件分析GFAP阳性率，GFAP阳性率=GFAP染色面积/组织总面积。

1.2.4 Western blot检测伤段脊髓组织cathepsin B、caspase-3、GFAP和vimentin蛋白水平：快速取出组织，0.9%氯化钠溶液冲洗后置于液氮中保存。提取组织总蛋白，用BCA法检测蛋白浓度后，进行SDS-PAEE，转膜、加一抗(1∶1 500)在4 ℃孵育过夜，次日，洗膜加二抗(1∶5 000)室温孵育2 h，TBST洗膜后，加ECL发光液，在凝胶成像系统中拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 实验组大鼠后肢运动功能BBB评分

与假手术组相比，模型组及Nec-1组BBB评分值均显著降低(P<0.05)，与模型组相比，Nec-1组BBB评分值显著升高(P<0.05)(表1)。

2.2 各组胶质瘢痕的形成

与假手术组相比，模型组7和14 d，Nec-1组GFAP阳性率显著升高(P<0.05)，与模型组相比，Nec-1组GFAP阳性率显著降低(P<0.05)(图1，表2)。

表1 各组大鼠后肢运动功能BBB评分Table 1 BBB score of hind limb motor function of rats in each

图1 免疫荧光检测大鼠脊髓组织GFAP表达Fig 1 Expression of GFAP in rat spinal cord was detected by immunofluorescence

表2 各组大鼠脊髓组织GFAP阳性表达率Table 2 Positive expression rate of GFAP in spinal cord of rats in each

2.3 脊髓组织GFAP及vimentin蛋白的表达

术后第7及14天，与假手术组相比，模型组及Nec-1组GFAP和vimentin蛋白显著升高(P<0.05)，与模型组相比，Nec-1组GFAP和vimentin蛋白显著降低(P<0.05)(图2)。

2.4 脊髓组织cathepsin B和caspase-3的表达

术后第7天、14天，与假手术组相比，模型组、Nec-1组cathepsin B、caspase-3蛋白显著升高(P<0.05)，与模型组相比，Nec-1组cathepsin B、caspase-3蛋白显著降低(P<0.05)(图3)。

3 讨论

脊髓损伤分为原发性损伤和继发性损伤，前者对脊髓组织造成机械性损伤， 后者多伴随着神经胶质细胞的凋亡和炎性反应等[5]。控制脊髓的继发性损伤，可以减少神经元坏死，促进神经轴突再生。Nec-1是程序性坏死的特异性抑制剂，小鼠脊髓损伤后，Nec-1通过抑制受体相关蛋白1(receptor interacting protein-1,RIP1)和RIP3的相互作用，减轻脊髓继发性损伤[6]。Nec-1可有效减少小鼠脑组织缺损，促进活动功能和学习能力。本研究表明，术后模型组和Nec-1组BBB评分值降低，Nec-1组BBB评分值升高，提示Nec-1可促进脊髓损伤小鼠后肢运动功能的恢复。

A：GFAP protein expression；B：vimentin protein expression， a.sham， b.model， c.Nec-1; *P<0.05 compared with sham group；#P<0.05 compared with model group

中枢神经系统损伤后，促进胶质瘢痕的形成。神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞特异性蛋白，中枢神经系统受损后，GFAP的表达量反映星形胶质细胞活化情况[7]。抑制星形胶质细胞增殖，可促进大鼠脊髓损伤恢复。中间丝波形蛋白(vimentin)是星形胶质细胞增生一种重要标志，脊髓损伤后，胶质瘢痕的形成与GFAP和vimentin的表达增加有关[8]。抑制GFAP和vimentin蛋白表达，抑制星形胶质细胞的活化，对脊髓损伤修复有重要作用[8]。本研究表明，术后第14天，模型组和Nec-1均可见NF-200荧光，与模型组相比，Nec-1组NF-200荧光标记强度降低，提示Nec-1干预可减少脊髓损伤大鼠瘢痕组织形成。进一步还观察到，模型组及Nec-1组大鼠脊髓组织中GFAP和vimentin表达升高，Nec-1组GFAP和vimentin表达降低，提示Nec-1可能降低脊髓损伤大鼠脊髓组织GFAP和vimentin蛋白表达。

A.cathepsin B protein expression；B.caspase-3 protein expression；a.sham；b.model；c.Nec-1; *P<0.05 compared with sham group； #P<0.05 compared with model group

细胞凋亡是脊髓的继发性损伤的主要症状之一，caspase家族是细胞凋亡中的调控因子[9]。Cathepsin B在神经细胞中促进细胞色素c的释放，促进caspase活化，引起细胞凋亡，Nec-1通过下调凋亡相关蛋白表达，有效缓解小鼠癫痫[10]。本研究表明，在脊髓损伤术后第7天和14天，模型组和Nec-1组cathepsin B及caspase-3蛋白表达均升高，与模型组相比，Nec-1组cathepsin B和caspase-3蛋白表达降低，与文献报道[11]一致。提示Nec-1可抑制脊髓损伤大鼠脊髓组织中cathepsin B和caspase-3表达。

调控cathepsin B和caspase-3的表达，抑制脊髓损伤大鼠胶质瘢痕形成，促进神经功能恢复。其具体作用机制尚需深入研究。