高良姜PAL 基因的序列和表达模式分析

黄琼林

（广东医科大学 基础医学院，广东 湛江 524023）

中药高良姜来源于姜科多年生草本植物高良姜Alpinia officinarumHance 的干燥根茎[1]，是我国传统药食两用大宗药材。高良姜具有温胃止呕、散寒止痛等功效，可用于治疗脘腹冷痛、胃寒呕吐、嗳气吞酸等症。 资源调查发现，高良姜野生资源已经基本灭绝，人工栽培高良姜也在逐年明显下降，不少地区已出现高良姜药材供不应求的态势，不能满足临床和民俗需要[2-3]。

黄酮是高良姜的主要成分和药效物质之一。高良姜含有高良姜素、高良姜酚、山柰素、山柰酚、槲皮素和异鼠李素等黄酮类化合物，这些化合物具有抗氧化、降尿酸、抗炎镇痛、抗癌等药理活性[4-5]。鉴于高良姜的药理活性成分比较清楚，通过基因工程调控黄酮类生物合成途径关键酶基因表达，促进高良姜药效成分的合成和提高高良姜药用质量，是缓解高良姜当前资源不足的方法之一。

苯丙烷代谢途径是黄酮类化合物生物合成的上游途径，苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）则是该途径的第一个关键限速酶，催化L-苯丙氨酸产生反式肉桂酸，再经香豆酸、芥子酸等中间产物及相应的催化酶的作用下，分别生成黄酮、木质素和酚类等代谢产物[6]。此外，PAL 也是植物初级代谢和次生代谢的关键连接点，对植物生长发育、花色形成、抗病抗逆等生理过程具有重要的调控作用[7]。目前，PAL基因已从膜荚黄芪[8]、华细辛[9]、枸杞[10]等中药材中获得克隆，而高良姜的黄酮生物合成相关酶基因研究的报道仍较少。

本研究拟基于高良姜转录组测序，挖掘高良姜PAL基因cDNA 序列，探讨其序列特征以及在高良姜不同组织中的表达差异，为今后高良姜PAL基因的功能鉴定和表达调控建立研究基础。

1 材料和方法

1.1 基因序列

在前期研究中，作者以产自道地产区——广东省徐闻县的高良姜为材料，采用因美纳NovaSeq 6000 平台进行转录组高通量测序，并通过序列组装获得147 652 条非重复序列基因[11]。本研究在此基础上，通过序列比对检索和注释高良姜PAL基因并确定其序列。

1.2 主要试剂

RNA prep Pure Plant Kit 试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；GoScript Reverse Transcription System 和GoTaq qPCR Master Mix 试剂盒均购自美国普洛麦格生物技术有限公司。

1.3 基因序列分析

采用Omiga 2.0 对高良姜PAL基因序列进行编码区及开放阅读框（Open reading frame，ORF）检索，并将其翻译成蛋白质序列。利用Protparam 和Protscale 软件分析基因序列的组成和亲/疏水性等理化特征。使用Conserved Domains 数据库分析编码蛋白质的保守功能域，利用Target 1.1 和TMHMM 软件完成编码蛋白质的转运肽、信号肽和跨膜结构分析。采用SOPMA 软件分析编码蛋白质的二级结构。运用ClustalX 和MEGA 软件完成编码蛋白质的多重序列比对和系统发育分析。

1.4 基因表达分析

采用实时定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）检测高良姜PAL基因在不同组织样品中的表达差异。分别以新鲜高良姜的根茎、茎和叶为材料，使用RNA prep Pure Plant Kit 提取总RNA，再用GoScript Reverse Transcription System 反转录合成cDNA。

根据检索所得的高良姜PAL基因序列，设计用于qPCR 的特异性引物，其中，上游引物的序列为：5'-CTTCAGGGCTACTCAGGCAT-3'；下游引物序列为：5'-GTAGGACAGGGGAACGAGG-3'。 参照GoTaq qPCR Master Mix 试剂盒的说明书，qPCR 反应体系总体积为20 μL，其中，2 × qPCR Master Mix 10 μL，10 μM 上、下游引物各0.3 μL，cDNA 模板适量，并用灭菌蒸馏水补足体积。qPCR 反应条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40 个循环。以β-tubulin 为内参基因，采用2-ΔΔCt计算高良姜PAL基因的相对表达量。

2 结果和分析

2.1 基因序列检索

通过在高良姜转录组数据中检索，获得一条注释为PAL基因的cDNA 序列，并将其命名为AoPAL。AoPAL序列长度为2 261 bp，其中含有2 130 bp编码区、44 bp 5'端非编码区和84 bp 3'端非编码区。AoPAL编码区包含2 130 个碱基，GC 含量为64.2%，编码710 个氨基酸，见图1。

图1 AoPAL 基因编码区核苷酸和氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide and encoded amino acid sequence of AoPAL coding region

2.2 系统发育关系分析

AoPAL等15 个植物来源的PAL基因的系统发育关系，见图2，15 个PAL基因聚类成两大分支，其中，AoPAL与单子叶植物小果野芭蕉、玉米和铁皮石斛等来源的PAL基因聚集为一支，而其它双子叶植物来源的PAL基因聚成另外一支，这些PAL基因的系统发育聚类结果与对应植物起源分类相符。AoPAL与源于单子叶植物的PAL基因具有较高的序列同源性和保守度，推测它们在功能上也有较高的相似性。

图2 15 个植物来源PAL 基因的系统发育关系聚类图Fig. 2 Phylogenetic tree of PAL genes from 15 plants

2.3 编码蛋白的功能分析

为了更好地理解AoPAL的功能，对AoPAL的编码蛋白进行保守功能域分析。将AoPAL编码蛋白的氨基酸序列导入Conserved Domains 数据库，保守功能域检索结果，见图3，编码蛋白AoPAL 具有多位活性位点，包含1 个从第8 位氨基酸到第710 位氨基酸的苯丙氨解氨酶的保守功能域，归属于苯丙氨解氨酶超级家族。结果表明，AoPAL 具有苯丙氨解氨酶的功能，而AoPAL即为高良姜苯丙氨解氨酶的编码基因。

图3 AoPAL 蛋白保守功能域示意图Fig. 3 Conserved domains of AoPAL

2.4 编码蛋白的特征分析

编码蛋白AoPAL 的分子量76.55 kDa，等电点为5.78，包含丙氨酸、亮氨酸等20 余种氨基酸。蛋白质不稳定指数为37.29，属于稳定蛋白质。AoPAL 多肽链整体表现为亲水性，没有出现明显的疏水区域，说明其属于水溶性蛋白质。

TMHMM 分析显示，AoPAL 整条多肽链均位于细胞膜外，不含任何跨膜结构域，说明AoPAL 在细胞质中发挥功能。亚定位分析也发现，AoPAL 不含有信号肽和转运肽，进一步表明了AoPAL 在细胞质中合成并执行相应的催化功能。

蛋白质二级结构分析显示，AoPAL 由407 个α-螺旋、64 个延伸链、44 个β-转角和199 个随意卷曲组成，表明其为以α-螺旋和随意卷曲为主要元件构成的混合结构型蛋白质。

2.5 基因表达分析

基于荧光定量PCR 计算的相对表达量，见图4，AoPAL在根茎、茎中的表达水平显著高于叶，其中，又以在根茎中的表达水平最高。

图4 AoPAL 在高良姜不同组织的中表达分析Tab. 4 Expression difference of AoPAL in various tissue of A. officinarum

3 讨论

PAL 在黄酮类、木质素以及其它活性成分的生物合成有着重要的作用，其表达与黄酮的积累密切相关[12]。关巍等[13]发现PAL 活性在彩色马铃薯发育期间与花色苷的积累呈现正相关性。郭肖等[14]研究表明水芹黄酮含量与PAL 活性的变化趋势一致，且二者相关系数极为显著。因此，调控PAL 的表达和活性可以有效地提高黄酮类化合物的合成。

转录组测序能以高通量模式挖掘无基因组参考物种的基因序列，是基因组图谱仍属空白的大多药用植物进行功能基因鉴定、活性成分的生物合成和调控机理研究的有效方法之一[15]。本研究通过转录组高通量测序获取AoPAL的cDNA 全长和编码区序列，相比同源克隆和 RACE 技术等传统的基因挖掘方法，具有简单、方便和高效等显著优势。生物信息学分析表明，AoPAL 氨基酸序列与已报道的植物PAL 氨基酸序列同源性较高，二级结构也与青天葵等单子叶植物相似，均是以α-螺旋和不规则卷曲为主。AoPAL 同样包含PAL-HAL 结构域，并归属苯丙氨酸解氨酶超级家族，因此说明AoPAL 是具有苯丙氨酸解氨酶活性的蛋白质。

植物PAL基因多以基因家族形式存在，不同植物中常含有2 ～ 6 个PAL基因家族成员，这些成员在不同组织中的表达模式以及在植物次生代谢产物的合成和调控过程所发挥的作用也各有不同[16-17]。本研究发现，AoPAL在高良姜的根茎中表达高于叶和茎两个地上部位，这与高良姜根茎部位药效成分含量较高并以根茎入药的事实相符。然而，AoPAL在高良姜黄酮类生物合成上涉及的具体通路和作用还有待进一步探讨。

4 结论

本研究基于转录组测序挖掘到高良姜次生代谢苯丙烷代谢途径的第一步关键限速酶基因AoPAL，明确了该基因的序列特征及其编码蛋白的功能，并探讨了其在高良姜不同组织中的表达模式，为高良姜黄酮类药效成分的生物合成和基因调控奠定了基础。