筋骨伤喷雾剂HPLC指纹图谱建立及8种成分测定

王彬宇， 黄家宇， 陈思忆， 杜秋莹， 鲁婷婷， 张 会， 李 莉

(贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550025)

筋骨伤喷雾剂由赤胫散、淫羊藿、赤芍、地龙、制草乌、薄荷脑组成，具有舒筋活络、消肿止痛、散瘀止血的功效[1]，临床用于治疗软组织损伤[2-3]，已收载于2019年版《国家基本医疗保险、工伤保险和生育保险药品目录》。但该制剂质量控制方法有局限，除了标准中的薄层鉴别和对芍药苷含量测定外，前期仅有对几种成分含量测定的报道[4-5]，缺乏全面评价。

指纹图谱技术可对已知或未知成分进行分析，在有效成分不完全明确的情况下，能较为全面地反映中药制剂中化学成分的相对关系，其中以HPLC为基础的指纹图谱适用性强，是质量评价和新药研发中最常用的方法[6-10]。本实验建立了筋骨伤喷雾剂HPLC指纹图谱，并同时测定没食子酸、没食子酸乙酯、芍药苷、鞣花酸、山柰苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷含量，以期表征该制剂所含成分的整体特性，为其质量评价提供科学依据。

1 材料

Agilent 1260高效液相色谱仪(配置DAD紫外检测器，美国Agilent公司)；MS105DU电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。筋骨伤喷雾剂共14批(100 mL/瓶，批号分别为20180901、20181105、20190102、20190302、20190408、20190502、20190801、20191003、20191006、20191101、20191107、20200102、20200401、20200604，编号S1～S14，贵州远程制药有限责任公司)。没食子酸乙酯对照品(批号 120915，纯度≥98%)购自北京盈泽纳新化工技术研究院；鞣花酸对照品(批号 GZDD-0272，纯度≥98%)购自贵州迪大科技有限责任公司；没食子酸(批号110831-201204)、芍药苷(批号110736-201337)、淫羊藿苷(批号110737-200415)对照品均购自中国食品药品检定研究院；朝藿定B(批号 wkq20081309)、山柰苷(批号 wkq20081904)、朝藿定C(批号 wkq20042308)对照品均购自四川省维克奇生物科技有限公司，纯度均≥98%。乙腈为色谱纯；磷酸为分析纯；水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 ACE C18-AR色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0～5 min，5%～10%A；5～45 min，10%～15%A；45～50 min，15%～17%A；50～55 min，17%～20%A；55～80 min，20%～30%A；80～100 min，30%～100%A)；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长230、254、270 nm；进样量5 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取没食子酸、没食子酸乙酯、芍药苷、鞣花酸、山柰苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为5.23、5.14、10.32、5.11、0.98、1.07、4.05、1.28 mg/mL的贮备液，分别量取适量，甲醇稀释，即得(每1 mL分别含没食子酸523.00 μg、没食子酸乙酯257.00 μg、芍药苷1 032.00 μg、鞣花酸265.72 μg、山柰苷98.00 μg、朝藿定B 117.70 μg、朝藿定C 405.00 μg、淫羊藿苷128.00 μg)。

2.2.2 供试品溶液 取喷雾剂适量，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 单味药材溶液 取赤胫散、淫羊藿、赤芍、制草乌、地龙适量，按相关工艺制备，即得。

2.2.4 阴性样品溶液 按处方比例及制备工艺，制备缺赤胫散、缺淫羊藿、缺赤芍、缺赤胫散和赤芍的阴性样品，按“2.2.3”项下方法制备，即得。

2.3 HPLC指纹图谱建立

2.3.1 精密度试验 取本品(S7)适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，以鞣花酸(15号峰)为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD均小于0.85%，相对峰面积RSD均小于3.26%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取本品(S7)适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，以鞣花酸(15号峰)为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD均小于0.84%，相对峰面积RSD均小于3.88%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取本品(S7)适量，室温下于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，以鞣花酸(15号峰)为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD均小于0.40%，相对峰面积RSD均小于3.78%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4 图谱生成 取14批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)软件，以S1为参照图谱，选择中位数法，设定时间窗宽度为0.3 min，生成对照图谱，经多点校正后进行色谱峰重叠与匹配，共标定36个共有峰，见图1。

图1 14批样品HPLC指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints for fourteen batches of samples

2.3.5 共有峰指认及归属 将对照指纹图谱与对照品保留时间、紫外吸收光谱进行比对，指认了8种成分，分别为4号峰(没食子酸)、12号峰(没食子酸乙酯)、14号峰(芍药苷)、15号峰(鞣花酸)、18号峰(山柰苷)、25号峰(朝藿定B)、26号峰(朝藿定C)、27号峰(淫羊藿苷)，其中鞣花酸分离度较好，保留时间适中，峰面积最大，峰型稳定，而且在所有样品中均存在，故选择其作为参照峰(S)，色谱图见图2。将单味药材图谱与样品图谱进行比对，确认14号峰来源于赤芍，15号峰来源于赤胫散，18、25、26、27号峰来源于淫羊藿，4、12号峰为赤胫散与赤芍共有，色谱图见图3。以鞣花酸保留时间、峰面积为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD小于0.73%，表明其出峰时间较稳定；相对峰面积RSD在0～118.23%之间，表明各批样品中不同成分含量差异较大。

4.没食子酸 12.没食子酸乙酯 14.芍药苷 15.鞣花酸 18.山柰苷 25.朝藿定B 26.朝藿定C 27.淫羊藿苷4.gallic acid 12.ethyl gallate 14.paeoniflorin 15.ellagic acid 18.kaempferin 25.epimedin B 26.epimedin C 27.icariin图2 对照指纹图谱Fig.2 Reference fingerprint

2.3.6 相似度分析 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)软件测定14批样品相似度，结果见表1，可知相似度均大于0.916，表明各批样品之间具有较高的相似性。

2.4 各成分含量测定

2.4.1 系统适用性考察 取供试品、对照品、阴性样品溶液各5 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图4。由此可知，阴性无干扰，各成分色谱峰分离度均大于1.5，理论塔板数均大于17 000。

2.4.2 线性关系考察 取“2.2.1”项下对照品溶液适量，甲醇逐级稀释成系列质量浓度，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表2。由此可知，各成分在各自范围内线性关系良好。

2.4.3 精密度试验 取本品(S7)适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得没食子酸、没食子酸乙酯、芍药苷、鞣花酸、山柰苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷峰面积RSD分别为2.30%、2.30%、2.29%、2.45%、2.70%、2.34%、2.42%、2.43%，表明仪器精密度良好。

4.没食子酸 12.没食子酸乙酯 14.芍药苷 15.鞣花酸18.山柰苷 25.朝藿定B 26.朝藿定C 27.淫羊藿苷4.gallic acid 12.ethyl gallate 14.paeoniflorin 15.ellagic acid18.kaempferin 25.epimedin B 26.epimedin C 27.icariin图4 各成分HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分线性关系

2.4.4 重复性试验 取本品(S7)适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、没食子酸乙酯、芍药苷、鞣花酸、山柰苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷峰面积RSD分别为1.42%、2.27%、1.38%、1.21%、2.25%、2.08%、1.79%、1.98%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验 取本品(S7)适量，室温下于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、没食子酸乙酯、芍药苷、鞣花酸、山柰苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷峰面积RSD分别为0.24%、2.06%、0.89%、1.63%、0.78%、0.83%、0.54%、0.49%，表明溶液在室温下24 h内稳定性良好。

2.4.6 加样回收率试验 精密量取各成分含量已知的同一批本品(S7)2 mL，共6份，置于5 mL量瓶中，加入对照品溶液适量，甲醇定容，混匀，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，没食子酸、没食子酸乙酯、芍药苷、鞣花酸、山柰苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷平均加样回收率分别为98.92%、94.02%、99.84%、101.32%、94.15%、106.61%、93.37%、103.74%，RSD分别为1.38%、0.47%、2.83%、0.46%、0.80%、0.73%、1.07%、2.45%。

2.4.7 样品含量测定 取14批样品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

3 讨论

3.1 色谱条件选择 本实验考察了流动相甲醇-0.1%冰醋酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-水、乙腈-0.1%冰醋酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水的洗脱效果，发现乙腈-0.1%磷酸分离度较高，色谱峰较多。再采用DAD检测器进行全波长扫描，通过各色谱峰响应来确定波长转换时间。

表3 各成分含量测定结果(μg/mL，n=3)

3.2 指标成分选择 赤胫散中没食子酸、鞣花酸具有抗炎、抗菌活性[11-12]，不良反应小，广泛应用于食品和医疗领域；赤芍中没食子酸乙酯、芍药苷具有抗氧化抗菌活性[13-14]；异戊烯基黄酮及其苷类(山柰苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷)是淫羊藿主要活性成分，具有抗骨质疏松方面的药理作用[15-16]。上述8种成分药理作用均与筋骨伤喷雾剂功能主治相关，故本实验选择它们进行含量测定。

3.3 HPLC指纹图谱、含量测定分析 14批样品HPLC指纹图谱中标定了36个共有峰，指认出其中8个；相似度均大于0.9，图谱形貌基本一致，表明成分组成、出峰时间均一，但相对峰面积RSD略大；不同批次样品中同一成分含量也有所差异，可能与药材产地、贮藏条件及时间等因素有关。因此，在筋骨伤喷雾剂生产过程中应控制药材来源，规范贮藏条件，并关注各成分含量变化。

4 结论

本实验建立了筋骨伤喷雾剂HPLC指纹图谱，并同时测定没食子酸、没食子酸乙酯、芍药苷、鞣花酸、山柰苷、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷含量，这种指纹图谱定性结合有效成分定量的方法快速简便，分离度良好，化学成分信息丰富，可对该制剂进行整体性评价并反映其内在质量，从而为进一步质量控制提供参考。