姜黄素预处理对缺血-再灌注所致急性肾损伤大鼠肾组织血管内皮修复和内皮祖细胞归巢的影响▲

倪 琦 林 化

(广西中医药大学第一附属医院1 科研部，2 重症医学科，南宁市 530023，电子邮箱：danilaile@sohu.com)

缺血-再灌注是导致急性肾损伤的常见原因，常见于肾脏外科手术、肾移植、肾脏体外冲击波碎石等。缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)可引起肾小管上皮细胞缺血、坏死，甚至导致急性肾衰竭，其始动因素是毛细血管内皮损伤，因此减轻血管内皮损伤是预防和治疗肾脏IRI的关键[1]。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)作为多能造血干细胞之一，在生理或病理条件下可以从骨髓中动员至外周血，并随之迁移、归巢至受损的组织、器官局部，参与损伤血管的修复[2]，目前已被广泛应用于缺血组织的血运重建[3]。因此，促进EPC向肾脏归巢可能有利于肾脏毛细血管内皮细胞的修复，从而可改善肾脏的IRI。

姜黄素是从姜黄属类植物根茎中提取的一种多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抑制动脉粥样硬化等广泛的药理作用[4]。姜黄素还能够保护或改善血管内皮功能，对内皮功能的恢复有着重要作用[5]。此外有研究表明，姜黄素可以减轻内毒素休克诱发的兔急性肾损伤[6]。姜黄素不仅对脑、卵巢等器官的IRI具有保护作用[7-8]，还能通过提高血清超氧化物歧化酶含量、降低丙二醛含量，来减轻大鼠肾脏的IRI[9]。然而姜黄素能否通过趋化EPC促进血管内皮的修复，从而发挥减轻缺血-再灌注所致急性肾损伤的作用，尚未见有相关研究。本研究通过建立大鼠肾脏IRI模型，探讨姜黄素是否可以通过促进EPC归巢以修复损伤的肾脏毛细血管内皮，从而改善缺血-再灌注导致的急性肾损伤。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂：姜黄素(美国TargetMol公司，批号：T1516)，用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)将姜黄素溶解至200 mg/mL；苏木精染液(珠海贝索生物技术有限公司，批号：BA-4097)；CD31抗体(美国Abcam公司，批号：ab182981)；兔抗大鼠 CD133抗体(美国Abcam公司，批号：ab19898)；小鼠抗大鼠CD34抗体(博奥森生物技术有限公司，批号：bsm-16538M)；辣根过氧化物酶标羊抗兔IgG(美国Jackson ImmunoResearch公司，批号：115-035-003)；Alexa Fluor 594标记羊抗鼠IgG(美国Cell Signaling Technology公司，批号：#8890)；Alexa Fluor 488标记羊抗兔IgG(美国Cell Signaling Technology公司，批号：4412s)；阿利新蓝-过碘酸-雪夫染色试剂盒(索莱宝生物技术有限公司，批号：G1285)。

1.1.2 仪器：全自动脱水机(德国徕卡公司，型号：ASP300S)，全自动轮转石蜡切片机(美国Thermo Scientific公司，型号：HM355S)，展烤片机(天津爱华医疗器械有限公司，型号：ZKPJ-1A型)，恒温孵育箱(上海一恒科学仪器有限公司，型号：DHP-9052)。

1.1.3 动物与实验分组：雄性无特定病原体级SD大鼠24只，8～12周龄体重180～220 g，购于广西医科大学动物实验中心[许可证编号:SCXK(桂)2014-0002]。大鼠饲养在室内通风及光线良好、温度22 ℃、湿度50%的实验室环境中。将大鼠按照随机数字表法分为正常对照组、肾脏IRI模型组、阴性对照组、姜黄素干预组，每组6只。姜黄素干预组大鼠于造模前7 d开始腹腔注射姜黄素(200 mg/kg，1次/d)，阴性对照组予1 mL/kg的DMSO腹腔注射，姜黄素干预组和阴性对照组均于第7天给药1 h后造模，正常对照组及肾脏IRI模型组均不给予DMSO、姜黄素及其他干预。

1.2 方法

1.2.1 建模：各组大鼠均于术前12 h禁食，自由饮水，称重，10%水合氯醛(3.3 mL/kg)腹腔注射，充分麻醉后仰卧位固定于鼠板上，剪毛备皮、消毒，沿腹中线做4～5 cm的切口,逐层切开。用棉签充分暴露大鼠左侧肾脏，分离肾门周围的结缔组织和脂肪组织，充分暴露肾脏血管，保护输尿管，用动脉夹夹闭肾动脉，肾脏颜色由鲜红色变暗紫色，说明缺血模型造模成功。40 min后松开动脉夹，肾脏血流恢复，肾脏在十几秒内恢复为粉色。往腹腔中滴入无菌生理盐水，逐层缝合肌肉、皮下组织和皮肤，碘附消毒切口后送回饲养笼，正常进水、进食，24 h后处死各组大鼠，摘取左侧肾脏，最大切面剖成两半，一半固定于10%中性福尔马林溶液中待检，另一半于-80℃保存。

1.2.2 阿利新蓝-过碘酸-雪夫染色：取出固定于10%中性福尔马林溶液的肾组织，脱水，石蜡包埋，制作厚度为4 μm的石蜡切片。石蜡切片脱蜡至水，水洗3 min，阿利新蓝染色液染色20 min，蒸馏水洗涤，高碘酸中氧化5 min，自来水冲洗，蒸馏水浸洗，雪夫试剂浸染20 min，流水冲洗，苏木素复染2 min，蒸馏水水洗，分化液分化2～5 s，蒸馏水水洗，Scott蓝化液返蓝，水洗，逐级常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。分别于每张切片肾皮质区随机取5个视野(200倍镜)，计数每个视野下扩张肾小管的数量(取平均值)。

1.2.3 免疫荧光双染检测：肾组织石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，血清封闭，滴加一抗兔抗大鼠CD133抗体(1 ∶100)、小鼠抗大鼠CD34抗体(1 ∶100)，4℃过夜，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗片，滴加Alexa Fluor 594标记羊抗鼠IgG(1 ∶500)和Alexa Flour 488标记的羊抗兔 IgG(1 ∶500)，37℃孵育0.5 h，PBS洗片，滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)，PBS洗片，封片。CD133阳性细胞为绿色荧光，CD34阳性细胞为红色荧光，CD133/CD34双阳性细胞即为EPC，显示为黄色荧光。

1.2.4 免疫组化染色：肾组织石蜡切片脱蜡至水，抗原修复、3%过氧化氢封闭，血清封闭，加入CD31抗体(1 ∶2 000)，4℃过夜，PBS洗片后，加入二抗辣根过氧化物酶标羊抗兔IgG(1 ∶300)，37℃孵育0.5 h，洗片后加二氨基联苯胺显色3 min，自来水冲洗，逐级常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。采用Image-Pro Plus图像软件分析免疫组化染色结果，每张切片于200倍镜的视野下采集10张图像，细胞胞质可见棕黄色颗粒表达(即为阳性区域)，计算阳性区域的平均光密度值。CD31广泛表达于肾小管周围毛细血管内皮细胞中，其光密度值反映CD31蛋白表达量，可以间接反映肾小管周围毛细血管的密度，光密度值越大，表示肾小管周围毛细血管的密度越高。

1.3 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 姜黄素对肾脏IRI大鼠肾小管损伤情况的影响 阿利新蓝-过碘酸-雪夫染色结果显示，正常对照组肾组织结构完整，肾小球、肾小管结构正常。与正常对照组相比，肾脏IRI模型组出现较多的扩张肾小管，小管上皮细胞扁平，还有部分肾小管上皮细胞肿胀、坏死，小管结构不清楚，肾间质局部可见炎细胞浸润，肾小球基底膜略微增厚。阴性对照组肾小管的情况与肾脏IRI模型组相同。与正常对照组相比，姜黄素预处理组也有少量扩张肾小管、上皮细胞肿胀，但扩张肾小管数目较肾脏IRI模型组减少，炎细胞浸润较少，肾小球基底膜正常。见图1。

肾脏IRI模型组和阴性对照组的扩张肾小管数量较正常对照组增多(均P<0.05)，阴性对照组与肾脏IRI模型组的扩张肾小管数量差异无统计学意义(P>0.05)；姜黄素干预组的扩张肾小管数量较肾脏IRI模型组和阴性对照组减少(均P<0.05)。见表1。

图1 各组大鼠肾脏组织阿利新蓝-过碘酸-雪夫染色情况(黑色星状图标代表扩张肾小管)

表1 4组大鼠扩张肾小管数量的比较(x±s，个)

2.2 姜黄素对肾脏IRI大鼠肾组织EPC归巢的影响 肾脏IRI模型组和阴性对照组肾组织EPC数量较正常对照组增多(均P<0.05)；阴性对照组与肾脏IRI模型组肾组织EPC数量差异无统计学意义(P>0.05)，而姜黄素干预组肾组织EPC数量较肾脏IRI模型组和阴性对照组增加(均P<0.05)。见表2、图2。

表2 4组大鼠肾组织EPC数量的比较(x±s，个)

图2 各组大鼠肾组织CD133/CD34免疫荧光双重染色情况

2.3 姜黄素对肾脏IRI大鼠肾组织CD31表达的影响 正常对照组CD31广泛表达于肾小管周围毛细血管内皮细胞中，呈黄色颗粒状分布于细胞质中。肾脏IRI模型组肾小管周围毛细血管内皮细胞中CD31阳性细胞显著减少。阴性对照组肾小管周围毛细血管内皮细胞中CD31阳性细胞表达情况与肾脏IRI模型组相当。姜黄素干预组较肾脏IRI模型组肾小管周围毛细血管内皮细胞CD31阳性细胞增多。见图3。

肾脏IRI模型组和阴性对照组肾小管周围CD31表达较正常对照组减少(均P<0.05)，阴性对照组与肾脏IRI模型组肾小管周围CD31表达差异无统计学意义(P>0.05)；姜黄素干预组肾小管周围CD31表达较正常对照组减少，但较肾脏IRI模型组和阴性对照组增多(均P<0.05)。见表3。

图3 各组大鼠肾组织中CD31的表达情况

表3 4组大鼠肾脏CD31表达的比较(x±s)

3 讨 论

肾脏IRI源于血管内皮的损伤，肾间质血管内皮损伤致血管腔狭窄，造成“无复流现象”，使肾小管上皮细胞摄取的氧和营养物质减少，导致其缺血、坏死，修复损伤的血管内皮细胞可预防或减轻肾小管上皮细胞的损伤，因此血管内皮细胞的损伤修复尤为重要[1]。干细胞技术尤其是EPC在组织损伤修复中的应用，受到越来越多的关注。EPC是一种骨髓源性的干细胞，通过动员、趋化、归巢、增殖和分化等多个过程参与损伤血管内皮细胞的修复[10]。组织缺氧或血管内皮损伤时，EPC被动员到外周血中，经过迁移、归巢到内皮损伤部位并分化为成熟内皮细胞，参与损伤内皮的修复及新生血管的生成。因此，EPC是血管内皮损伤修复的主要来源，是防治肾脏IRI的重要靶点。有学者发现，EPC可通过促进血管生成、抑制细胞凋亡、降低炎症水平和纤维化来减轻缺血诱导的急性肾损伤[11]。而组织损伤时EPC从骨髓中释放出来后能否有效迁移、归巢至受损部位，是血管再生和损伤修复的关键。多种中药有效单体和中药复方可以促进EPC的动员，具有促进EPC增殖、迁移、分化及形成血管能力等作用[12]。姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄、郁金、莪术等的根茎中提取的一种植物多酚。曾松柏等[13]的研究表明，姜黄素可以上调冠状动脉血管内皮生长因子的表达，而血管内皮生长因子参与血管新生过程，不仅可以诱导EPC向成熟内皮细胞分化，促进血管内皮细胞分裂增殖，同时还是EPC的重要趋化因子。

肾小管是肾脏中对缺血性损伤时最敏感的部位。缺血-再灌注后肾小管上皮细胞坏死、萎缩和凋亡，肾小管管腔扩大，并且坏死的肾小管上皮细胞脱落，形成细胞碎片，导致局部间质的炎症浸润，因此肾小管扩张是急性肾损伤的重要病理改变。本研究结果显示，肾脏IRI模型组的扩张肾小管数量较正常对照组增多，而姜黄素干预组的扩张肾小管数量较肾脏IRI模型组减少(P<0.05)，说明姜黄素预处理可以减轻缺血-再灌注诱导的肾小管损伤。

缺血-再灌注过程有可能损伤肾小管周围的毛细血管内皮细胞，引起肾小管周围毛细血管破坏，从而导致肾小管上皮细胞供血、供氧不足，影响肾小管正常的组织结构和功能。CD31是血管内皮细胞的特异性标志因子，主要存在于血管内皮细胞中，在肾脏中见于肾小球内皮细胞和肾小管周围毛细血管内皮细胞，CD31染色可以反映肾脏毛细血管的走行和微血管密度[14]。本研究结果显示，肾脏IRI模型组肾小管周围CD31表达量较正常对照组减少，而姜黄素干预组肾小管周围CD31表达量较肾脏IRI模型组增高(P<0.05)，表明姜黄素预处理可促进肾小管周围毛细血管内皮细胞的修复。在肾损伤时，EPC归巢至损伤部位，增殖分化为血管内皮细胞，参与肾小管周围毛细血管内皮的损伤修复。本研究结果显示，肾脏IRI模型组肾脏EPC含量较正常对照组增多，而姜黄素干预组肾脏EPC含量较肾脏IRI模型组进一步增多(P<0.05)，提示姜黄素预处理促进EPC归巢。因此我们推测姜黄素有可能通过促进EPC归巢，以修复肾小管周围毛细血管损伤的内皮细胞，从而改善IRI诱导的急性肾损伤。

干细胞治疗已经成为肾脏IRI的治疗新方向，但目前尚未找到EPC有效的激活剂。姜黄素作为我国的传统中药，具有药物安全浓度范围大、毒副作用小、价格低廉等特点，可用于治疗肾脏IRI，也可以作为EPC有效的激活剂应用于血管再生治疗，其有可能成为干细胞治疗的辅助性用药。但姜黄素促进EPC归巢及血管内皮损伤修复的具体机制及通路仍有待于进一步深入研究。