电针联合埋线治疗对功能性消化不良大鼠NLRP3水平及肠道运动功能的影响

刘伟伟，丁 麟，王秀艳，王晓燕

(1.中国人民解放军联勤保障部队第960医院，山东 济南 250000；2.山东中医药大学，山东 济南 250300)

功能性消化不良(Functional Dyspepsia，FD)是一种常见的功能性胃肠疾病，发病症状有餐后饱胀、早饱感和上腹胀痛等。该病区别于器质性病变，起病缓慢，反复发作[1]。随着现代人生活方式的改变和工作节奏的加快，FD的发病率正在不断上升。在亚洲，FD发病率达8%～23%[2]，据我国调查资料显示，FD患者占胃肠疾病专科门诊患者的50%左右。FD不仅影响患者生活质量和工作效率，还会给家庭和社会带来负担。当前治疗药物主要有抑制胃酸药和促胃动力药等[3]，西药虽然能在短时间内加速提升胃动力，但纯西药具有较高的刺激性，具有反弹性和局限性，对患者身体危害很大。中医在FD的治疗上有独特治疗优势。电针疗法将传统医学与现代技术相结合，用电针器输出脉冲电流，通过毫针作用于机体经络穴位治疗疾病，具有简便、可重复和副作用少等优点，但其缺点为无法长期作用于穴位[4]。穴位埋线治疗弥补了这一缺点，通过以针刺的方法将外科手术缝线埋在穴位里，对穴位起到长期的治疗作用，有效延长了刺激作用。手术缝线可完全吸收，对身体无任何副作用[5]。现已有研究表明，电针以及埋线治疗在临床上均取得了良好效果[6-7]，但其作用机制仍不清楚。因此，探究电针联合埋线治疗对FD大鼠的治疗机理至关重要，为其在临床上的应用推广提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级雄性SD大鼠50只，8周龄，体质量为(240±20)g，由珠海百试通生物科技有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(粤)2019-0051，动物使用许可证号：SYXK(粤)2019-0023，动物质量合格证号：BS601302。所有动物均严格按照动物饲养规则喂养，温度为25 ℃，湿度为60%，实验室适应性饲养1周后用于实验研究。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 试剂 番泻叶煎剂(购自亳州市亿弘堂药业有限公司，批号20200519，番泻叶水煎煮，去渣，浓缩成品率200%)；高脂饲料(购自上海华雅思创生物科技有限公司，批号D12405B，由84%玉米粉+15.5%猪油+0.5%胆固醇配制而成)；营养性半固体糊(将10 g羧甲基纤维素钠加入250 mL蒸馏水中，充分溶解，加入16 g奶粉、8 g糖、8 g淀粉和2 g活性炭粉，边搅拌边加入蒸馏水，制成300 mL黑色半固体营养糊)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒、组织裂解液、BCA蛋白测定试剂盒、硝酸纤维素膜和ECL显色试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为DP60113、P1007、SF0019、P3015和JK-10674)；兔抗大鼠Nod样受体蛋白3(NLRP3)抗体、兔抗大鼠β-肌动蛋白(β-actin)抗体和羊抗鼠二抗(购自艾博抗上海贸易有限公司，批号分别为ab263899、ab8277及ab6721)。

1.2.2 仪器 显微镜(购自日本尼康公司，型号LV100N POL)；凝胶成像系统(购自上海培清科技有限公司，型号JS-M9P)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组、造模及处理 将大鼠随机分为空白对照组、模型组、电针组、埋线治疗组以及电针联合埋线治疗组，每组各10只。除对照组外，其余各组均参照文献[8]，用高脂饲料喂养+番泻叶煎剂灌胃+束缚+游泳等多因素干预，复制FD肝郁脾虚证模型。在2周内用高脂饲料正常饲养，每天用番泻叶煎剂灌胃给药，每次3 mL。期间每天早8：00—11：00将大鼠束缚于束缚架上，分别固定大鼠的胸部和腹部，放入饲养箱中，每日3 h；每日14：00大鼠游泳15 min。最后，以大鼠饮食及活动少、被束缚时反应少、呼叫弱、毛发枯乱无光泽和大便稀溏不成形，表明成功建模，40只大鼠均造模成功。

成功建模后开始采用相应处理。参照《大鼠穴位图谱的研制》[9]，穴位选择中脘透下脘、足三里(双)、肝俞(双)以及脾俞透胃俞(双)。电针组大鼠皮肤经常规消毒后用一次性无菌针灸针，垂直刺入穴位20～50 mm，以得气为度，然后接通电针治疗仪，疏密波，频率5 Hz/100 Hz，强度2 mA，1次/d，30 min/d，两周为1个疗程。埋线治疗组大鼠取穴相同，用注射器针头作套管，在进针的同时将0.5 cm的外科手术缝线埋入穴位中，为保证线头不外露，用医用胶带粘好，每7 d进行埋线治疗1次，两周为1个疗程。电针联合埋线治疗组两种治疗方法都施用，以两周为1个疗程。空白对照组和模型组不进行治疗。

1.3.2 一般行为观察 干预期间，每天观察每组大鼠的一般情况，评分标准参照文献[8],见表1，一般情况评分为每项评分之和，总分为30分。干预结束后，比较各组大鼠在干预前和干预后的一般情况评分。

表1 各组大鼠一般情况评分标准表

1.3.3 各组大鼠胃排空率和小肠推进率的测定 将大鼠禁食24 h，灌服1次营养性半固体糊，用量为1 mL/100 g体质量，30 min后断头，处死大鼠。剖腹，结扎贲门与幽门取下胃，称质量，然后沿胃小弯剪开胃壁，置于生理盐水中充分清洗，再称其质量。胃排空率(%)=[1-(胃全重-胃净重)/灌胃量]×100%。取从幽门至回盲部的大鼠小肠，轻轻拉直，测量小肠的总长度以及小肠中黑色糊状物前沿到幽门的长度，就是黑色半固体糊在大鼠小肠中推进的长度。小肠推进率(%)=小肠中推进的黑色半固体糊长度/小肠的总长度×100%[10]。

1.3.4 组织学结构观察 将1.3.3中的肠管用生理盐水清洗后，置于4%多聚甲醛中固定，行常规石蜡切片。一部分切片采取HE染色。切片脱蜡复水，苏木精染色5 min后蒸馏水漂洗，1%盐酸酒精分色，伊红染色1 min，脱水，透明，封片。另一部分切片采取免疫组化染色。

1.3.5 小肠组织中NLRP3水平 切片常规脱蜡至水，3% H2O2室温处理5～10 min以灭活内源性酶，PBS漂洗3次；根据所用一抗性质选择合适的抗原修复方法；滴加封闭液，室温20 min，免洗；滴加1∶200稀释后的一抗(NLRP3抗体)4 ℃过夜，PBS洗涤3次×2 min；滴加1∶1 000羊抗鼠二抗稀释液，37 ℃孵育30 min，PBS洗涤3次×2 min；配制并滴加DAB显色液，镜下控制显色时间，蒸馏水洗涤；苏木精轻度复染；梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。显微镜下观察到阳性细胞被染为黄、棕色颗粒。

1.3.6 小肠组织中NLRP3蛋白表达水平 取1.3.3所保存各组大鼠小肠组织，剪碎，置于玻璃匀浆器中；加入含有苯甲基磺酰氟的裂解液，冰上反复匀浆。30 min后，4 ℃下12 000 rpm离心5 min，收集上清液，参照BCA试剂盒测定蛋白总浓度。配制10%分离胶、4%浓缩胶。取50 μg蛋白上样，沸水浴处理5 min使蛋白变性，冷却后可以上样。初始电压为80 V，待样品进入分离胶后，换成120 V。电泳结束后，将目的条带凝胶切除，转移到硝酸纤维素膜上，冰上进行转膜反应，电压为60 V，反应时间2 h。结束后用TBS清洗，用封闭液室温下摇床摇动封闭1 h，TBS清洗后，加入兔抗NLRP3、兔抗β-actin抗体一抗(稀释倍数1∶200)，4 ℃过夜。TBS清洗后加入羊抗鼠二抗(稀释倍数1∶2 000)，室温下孵育2 h，TBS清洗、ECL显色后置于凝胶成像系统中分析电泳条带。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠干预前后一般情况观察及评分比较

造模前各组大鼠精神状态良好，无异常反应；造模后，除空白对照组大鼠外，其余大鼠均出现了毛发脏乱枯黄不顺、懒动倦卧、厌食厌水、被束缚时反应小和大便不成型等现象。与空白对照组比较，模型组一般情况评分显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，电针组、埋线治疗组和电针联合埋线治疗组大鼠一般情况均有所改善，一般状况评分显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)；电针组与埋线治疗组差异无统计学意义(P>0.05)；与电针组、埋线治疗组比较，电针联合埋线治疗组一般情况评分显著上升，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠干预前后一般情况评分比较

2.2 各组大鼠胃排空率和小肠推进率比较

与空白对照组比较，模型组大鼠的胃排空率以及小肠推进率都有明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，各干预组大鼠的胃排空率以及小肠推进率都有明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，电针组与埋线治疗组差异无统计学意义(P>0.05)；与电针组、埋线治疗组比较，电针联合埋线治疗组胃排空率和小肠推进率显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠胃排空率和小肠推进率比较

2.3 各组大鼠小肠组织HE染色结果

与空白对照组比较，模型组大鼠小肠组织可见充血水肿及淋巴细胞-浆细胞浸润；与模型组比较，各干预组大鼠均有不同程度的减轻，效果最明显的是电针联合埋线治疗组。见图1。

图1 各组大鼠小肠组织HE染色(100×)

2.4 各组大鼠小肠组织NLRP3免疫组化染色结果

空白对照组仅见少量NLRP3蛋白阳性细胞；模型组可见大量NLRP3蛋白阳性细胞；与模型组相比，各干预组NLRP3蛋白阳性细胞均有所减少，减少最明显的是电针联合埋线治疗组。见图2。

图2 各组大鼠小肠NLRP3免疫组化染色(100×)

2.5 各组大鼠小肠组织NLRP3蛋白表达水平比较

与空白对照组比较，模型组大鼠的NLRP3蛋白表达量有明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，各干预组大鼠的NLRP3蛋白表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，电针组与埋线治疗组之间差异无统计学意义(P>0.05)；与电针组、埋线治疗组比较，电针联合埋线治疗组NLRP3蛋白表达量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3、表4。

注:A.空白对照组；B.模型组；C.电针组；D.埋线治疗组；E.电针联合埋线治疗组。

表4 各组大鼠小肠组织中NLRP3蛋白表达量

3 讨论

FD的发病通常与胃酸过多或过少、消化道动力异常和内脏高敏感性等因素有关，无器质性病变[11-12]。在临床工作中，FD患者由于缺乏对疾病的认识而承受着沉重的心理负担，严重影响了生活质量。目前对于该疾病的治疗主要依赖于西药，虽然能在短时间内起到很好的疗效，但其副作用也极大，因此有必要寻找更加安全有效的治疗方法以减少使用药物所产生的副作用，近些年有研究发现，相对于药物治疗，电针联合穴位埋线治疗不仅无副作用，而且在改善一些特定临床症状中疗效更佳[3-5]。

在本研究中，采用多种因素复制FD大鼠模型，高脂饲养造成胃排空延缓，束缚导致内脏高敏感，游泳导致肝郁脾虚，番泻叶模拟外邪所伤等[13]。结果发现，模型组大鼠的一般行为状态明显弱于空白对照组，皮毛暗沉，行为活动减少，对外部刺激的反应较慢，呆滞，嗜睡，大便不规则，胃排空率和小肠的推进率明显降低,表明FD大鼠模型已成功复制。

中医认为FD多因情志内伤、劳倦伤脾和中气不足等所致，中医辨证多见肝郁脾虚型[14]。肝主疏泄，脾胃共居中焦，共司水谷运化。肝气郁结则疏泄不利，脾气亦因之运化失职，累及中焦，胃气亦弱，最终导致血气运行不畅、胃肠功能紊乱[15]。临床研究表明，电针对FD有很好的治疗效果，其对FD患者的腹胀、腹痛、厌食、焦虑和抑郁情绪的改善可能与其恢复胃肠动力和激素水平、调节植物神经功能有关[16-18]。临床上采用中医穴位埋线方法改善已被确诊为肝郁脾虚型FD患者的胃脘痛、腹胀和嗳气等症状，以促进患者康复[19]。已有研究发现，电针联合穴位埋线可以有效治疗结肠慢传输型便秘[20-21]，但对二者合用治疗FD目前还未见报道。循经取穴均根据“经脉所通，主治所及”的原则，中脘、下脘、足三里、肝俞、脾俞和胃俞都是治疗消化疾病的常用穴位。《难经》说腑会中脘，中脘作为胃之募穴，配足三里常用来治疗腹胀痛；下脘则偏重于缓解小肠、脾不运化所导致的各种疾病；肝俞、脾俞和胃俞都冠有脏腑名，因此对该脏腑的疾病是有疗效的。在本研究中，采取电针联合埋线治疗通过上述各穴位作用于FD大鼠，发现大鼠一般行为基本恢复正常，一般行为评分、胃排空率以及小肠推进率均有明显升高且效果最为明显，比单用电针治疗或单用穴位埋线治疗效果更好。其原因可能是电针联合埋线治疗对穴位不但有电针的短时、强烈作用，也有穴位埋线治疗的长时、温和的作用效果，该结果表明，电针联合埋线治疗能够有效改善FD大鼠行为学变化及胃肠道功能。

NLRP3炎性体是机体内识别免疫系统病原体的重要蛋白，在炎症反应中起着关键作用[22]，有报道显示，其在肠粘连、结肠炎或其他炎症性肠病以及其他慢性炎症患者中有重要作用，可作为治疗效果的反应因子[23]，但其在FD中目前还尚未报道。本研究中，在模型组大鼠中NLRP3蛋白水平有明显提高，经过治疗后又显著下降，猜测NLRP3在FD中存在重要作用。而且，该结果表明电针联合埋线治疗可能通过改善FD大鼠肠道炎症状态，达到治疗FD的目的。

综上所述，电针联合埋线治疗对FD大鼠疗效显著，能明显减轻发病症状，可能与其降低NLRP3水平有关。本研究结果不仅为寻找新的FD有效治疗方法提供参考，还对电针联合埋线治疗在FD中的治疗机制研究具有重要意义，但本研究未设抑制剂或激活剂加以验证，后续还需进一步实验。