白芨多糖对心肌梗死大鼠PI3K/AKT/GRP78信号通路及心肌细胞内质网应激凋亡的影响

王建营 李晶 于飞 姚光 解立杰 张全意

(滨州医学院附属医院，山东 滨州 256603)

心肌梗死(MI)属于冠心病的危急重症之一，是因冠状动脉硬化、堵塞而导致的冠状动脉的血流量下降、心肌组织缺血缺氧坏死性疾病，其发病率和死亡率上升，严重影响人们的生命健康〔1，2〕。积极寻找有效的治疗MI的方法，一直是临床研究的重点和难点之一〔3〕。冠状动脉阻塞和粥样硬化导致的心肌组织缺血可触发内质网应激(ERS)，适当的ERS可保护心肌细胞免受损伤，而长期严重的ERS反而会促进细胞凋亡，加重组织损伤〔4〕，而ERS介导心肌细胞凋亡，在心肌缺血、心室重构等心血管病理发展过程中的调控作用越来越受到临床研究的重视〔5，6〕。研究发现，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT) 信号通路可调控ERS，诱导和促进ERS标志蛋白葡萄糖调节蛋白(GRP)78蛋白表达，参与细胞凋亡过程〔7，8〕。但PI3K/AKT/GRP78通路在MI心肌细胞凋亡过程的作用研究较少。白芨多糖是从中药白芨块茎中提取分离得到的一种新型葡萄甘露聚糖活性物质，有促进造血、修复溃疡组织损伤等多种药理作用，并逐渐受到科研探讨和药物研发的关注〔9〕。但白芨多糖对MI的保护作用，及PI3K/AKT/GRP78通路介导的 ERS心肌细胞凋亡的影响未见报道，本文对此进行探讨，以期为白芨多糖在MI领域的开发应用提供实验参考。

1 材料及方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠62只，体重 200～220 g，清洁级由滨州医学院附属医院实验动物中心提供，批号SYXK(鲁)20180022。本研究经医院动物伦理委员会批准同意，批号为〔2019〕伦审字(KT-002)。白芨多糖(批号：20180624008，购自爱必信上海生物公司，规格：20 mg)；三苯基氯化四氮唑(TTC)试剂盒(货号：YANJ-298-96-4，购自上海研谨生物公司)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(批号：20190721003，购自上海联迈生物工程公司)；肌酸激酶同工酶(CK-MB)试剂盒(货号：CSB-E14402，购自上海振誉生物公司)；心肌肌钙蛋白(cTn)I试剂盒(货号：JC-E8061，购自上海机纯实业公司)；PI3K(货号：ab39307)、AKT磷酸化(p-AKT,货号：ab38449)、GRP78抗体(货号：ab191023)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)磷酸化(p-PERK)抗体(货号：ab192591)、真核细胞翻译起始因子(eIF)2α磷酸化(p-eIF2α)抗体(货号：ab32157)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-12抗体(货号：ab140882)均购自美国Abcam公司；XSP-2CA光学显微镜购自上海坤诚。

1.2方法

1.2.1模型制备及分组处理 参照文献〔10〕将52只大鼠开胸暴露心脏，结扎左冠状动脉前降支构建MI模型，以结扎后心前壁变白、心电图ST段抬高视为结扎成功，术后大鼠成活视为造模成功(50只成功，2只结扎失败死亡)。随机分为模型组、白芨多糖低、中、高剂量组、阳性对照组，每组10只；另取10只大鼠，不结扎左冠状动脉前降支作为假手术组。术后第2天开始给药，白芨多糖低、中、高剂量组及阳性对照组〔10〕均参照文献〔11〕设置剂量(白芨多糖100 mg/kg、白芨多糖200 mg/kg、白芨多糖400 mg/kg及卡托普利2.25 mg/kg)并灌胃给药4 w，1次/d，假手术组与模型组给予等量生理盐水。

1.2.2血清心肌损伤标志物检测 麻醉大鼠，取颈动脉血约2 ml，按试剂盒说明书方法测CK-MB、cTnI水平。

1.2.3各组MI面积测定 随机取6只大鼠，麻醉处死，解剖心脏，生理盐水漂洗干净后，沿冠状面切成5片(厚度大致相同)，TTC染液(2%浓度)避光染色30 min(37℃水浴)后，拍照，以Image pro软件分析检测MI面积：MI面积=淡白色区域面积/全心脏切片面积×100%。

1.2.4各组心肌组织细胞损伤及凋亡病理染色 随机取6只大鼠，麻醉处死，解剖得完整心脏，剪取约0.5 g心尖组织于-80℃保存备用。剩余组织于多聚甲醛中固定24 h后，常规制成厚度为5 μm的石蜡切片，按HE及Tunel染色试剂盒说明书染色处理后，在光镜下观察染色情况。Tunel染色的切片，于高倍显微镜下观察并用Image Pro Plus5.0系统计算阳性染色细胞数目，并计算凋亡率=阳性染色细胞数目/(未染色细胞数目+阳性染色细胞数目)×100%。

1.2.5Western印迹检测 PI3K、p-AKT、GRP78、p-PERK、p-eIF2α蛋白及caspase-12蛋白相对表达水平取冰冻心肌组织，4℃解冻后，机械匀浆、分离得均浆上清液，轴提蛋白后用二喹啉甲酸(BCA)法测蛋白浓度，取50 μg蛋白进行垂直电泳及转膜反应，5%脱脂奶粉封闭2 h(室温)及缓冲液清洗后，滴加1∶1 000稀释的一抗(PI3K、p-AKT、GRP78、p-PERK、p-eIF2α、caspase-12)及1∶2 000稀释的内参(β-actin)抗体，4℃孵育过夜，滴加1∶1 000稀释的羊抗兔二抗孵育2 h(室温)，加入显影液显影，显影系统曝光并拍照，Image-J软件分析蛋白条带的相对灰度值，以相对灰度值代表各蛋白的相对表达水平。

1.3统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1白芨多糖对大鼠MI面积的影响 TTC染色可见模型组心肌组织淡白色染色较多，与假手术组MI面积〔(0.06±0.01)%〕比较，模型组〔(29.03±2.38)%〕白芨多糖低、中、高剂量组〔(22.12±2.24)%、(16.62±2.11)%、(10.51±2.02)%〕及阳性对照组〔(10.08±2.00)%〕均显著升高(均P<0.05)；与模型组比较，白芨多糖低、中、高剂量组及阳性对照组MI面积均显著降低，且白芨多糖剂量越高，MI面积降低越显著(均P<0.05)；白芨多糖高剂量组与阳性对照组MI面积差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 各组MI TTC染色

2.2各组心肌组织HE染色病理损伤形态观察 假手术组心肌结构完整清晰，组织无损伤；模型组心肌组织纤维变性、间质水肿、炎性细胞浸润等病理损伤严重；白芨多糖剂量越高上述病理损伤缓解越明显，白芨多糖高剂量组对心肌损伤的改善作用与阳性对照组相近。见图2。

图2 各组心肌组织(HE染色，×100)

2.3各组心肌组织Tunel染色及细胞凋亡率比较 凋亡细胞被染成棕色，模型组心肌细胞棕色染色加深，与假手术组心肌细胞凋亡率〔(19.23±3.69)%〕比较，模型组、白芨多糖低、中、高剂量组及阳性对照组〔(66.68±5.21)%、(50.12±5.04)%、(41.05±4.81)%、(30.61±4.02)%、(29.08±3.99)%〕均显著上升，且白芨多糖剂量越高心肌细胞凋亡率降低越明显(均P<0.05)；白芨多糖高剂量组与阳性对照组心肌细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 各组心肌组织(Tunel染色，×100)

2.4各组血清中CK-MB、cTnI水平 与假手术组比较，其余各组CK-MB、cTnI水平均显著升高(P<0.05)。白芨多糖各剂量组及阳性对照组血清CK-MB、cTnI水平均显著低于模型组(P<0.05)，且白芨多糖剂量越高心肌损伤相关酶水平降低越明显(均P<0.05)；白芨多糖高剂量组与阳性对照组CK-MB、cTnI水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组血清CK-MB、cTnI水平比较

2.5各组心肌组织PI3K、AKT、GRP78蛋白达水平比较 与假手术组比较，其余各组心肌组织PI3K、p-AKT蛋白水平均显著降低，(P<0.05)，GRP78蛋白水平均显著上升(均P<0.05)。白芨多糖各剂量组及阳性对照组PI3K、p-AKT蛋白水平均显著高于模型组，而GRP78水平均显著低于模型组(均P<0.05)；且白芨多糖剂量越高，PI3K、p-AKT上调及GRP78下调趋势越明显(均P<0.05)；白芨多糖高剂量组和阳性对照组PI3K、p-AKT、GRP78水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。见图4，表2。

1～6：假手术组、模型组、白芨多糖、低剂量组、白芨多糖中剂量组、白芨多糖高剂量组；图5同图4 Western印迹检测PI3K、p-AKT/AKT、GRP78蛋白的表达

2.6各组心肌组织PERK、p-eIF2α、caspase-12其余各蛋白水平比较 与假手术组比较，其余各组心肌组织p-PERK、p-eIF2α、caspase-12蛋白水平均显著升高(均P<0.05)；白芨多糖各剂量组及阳性对照组p-PERK、p-eIF2α、caspase-12蛋白水平均显著低于模型组(均P<0.05)，且白芨多糖剂量越高上述蛋白降低越明显(均P<0.05)；白芨多糖高剂量组与阳性对照组PERK、p-eIF2α、caspase-12水平差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表2，图5。

图5 Western印迹检测p-PERK、p-eIF2α、caspase-12蛋白的表达

3 讨 论

MI在细胞水平的病理变化包括心肌细胞凋亡或坏死、细胞外基质大量沉积等〔12〕，MI为心脏突然停止供血疾病之一，中医治疗MI常以活血化瘀为主，并取得较好的疗效〔13〕。白芨多糖有促进造血、抗炎抗菌、修复受损组织的作用〔9〕。王刚等〔14〕发现白芨多糖可通过抗氧化、抗炎反应修复人受损伤的角质细胞；李浩宇等〔11〕发现白芨多糖可抑制大鼠肺纤维化过程。而MI是因冠状动脉血管阻塞，组织缺血而发生氧化应激和炎症反应〔15〕，本研究结果提示白芨多糖可改善MI大鼠心肌细胞损伤、凋亡及组织坏死，表明白芨多糖对MI有一定的治疗作用。

细胞凋亡是导致心肌缺血坏死的重要机制之一，而ERS介导的相关凋亡途径参与了心肌组织缺血坏死过程〔16〕。GRP78被认为是ERS的标志蛋白，当机体处于ERS状态时，过表达的GRP78可促进PERK解离、活化，解离、活化PERK又可促进eIF2α发生磷酸化，磷酸化的eIF2α可促使 ATF4 发生转录翻译而导致细胞凋亡〔17〕。苏学旭等〔18〕发现芪蛭三七汤可抑制MI大鼠心肌细胞凋亡，并推测其抑制MI大鼠心肌细胞凋亡和心室重构作用，可能与抑制GRP78/PERK/eIF2α信号通路激活诱导的ERS凋亡相关。本研究提示GRP78/PERK/eIF2α信号通路激活，MI大鼠心肌细胞严重，与文献〔18〕研究一致，表明MI过程中，心肌组织发生ERS凋亡。研究发现，PI3K/AKT通路不仅参与调控细胞炎症、氧化应激、凋亡途径，还参与ERS细胞凋亡过程〔8〕。崔伟等〔19〕发现黄芪甲苷可通过激活PI3K/AKT通路，降低GRP78及caspase-12表达，抑制内皮细胞ERS，保护内皮细胞免受损伤；阳光等〔20〕发现PI3K/AKT信号通路在肝纤维化大鼠肝细胞ERS和凋亡过程发挥重要作用；Liu等〔7〕发现GRP78与PI3K/AKT之间存在双向调节。本研究结果表明白芨多糖改善MI大鼠心肌细胞凋亡坏死作用，可能是通过激活PI3K/AKT通路，抑制GRP78/PERK/eIF2α信号通路蛋白表达，降低心肌细胞ERS凋亡来实现的。综上，白芨多糖可激活PI3K/AKT通路，抑制GRP78/PERK/eIF2α信号通路蛋白表达，降低心肌细胞ERS凋亡，改善MI大鼠心肌坏死。为白芨多糖在MI领域的治疗提供一定依据。但MI心肌细胞ERS凋亡途径复杂，涉及多个因子多条通路共同调节，白芨多糖对PI3K/AKT及GRP78/PERK/eIF2α信号通路的调节作用，还应设置通路抑制剂进行深入验证。