天麻蛋白制备抗铜绿假单胞菌多肽最佳胃蛋白酶水解条件∗

陈行书, 刘伟朋, 薛慧星, 童 雨, 王华林, 张孝林

(安徽科技学院生命与健康科学学院, 安徽 凤阳 233100)

天麻(Gastrodiaelata Blume)是兰科天麻属, 其球茎依靠从寄生的蜜环菌的菌丝获取营养的多年生草本植物, 然而, 天麻的球茎被密环菌侵染和寄生确没有被真菌感染, 证明天麻中含有抗真菌成分。 后来人们研究发现天麻抗真菌活性成分是抗真菌蛋白[1]。 近期, 逯家辉等把抗菌蛋白在蛋白酶水解成为短肽, 发现具有更强的抗菌活性并可开发成抗菌凝胶[2]。 但蛋白酶水解蛋白受蛋白酶的种类和用量, 蛋白酶的水解温度, 蛋白酶的水解时间, 蛋白酶水解酸碱度(pH)等因素的影响。 逯家辉等是利用木瓜蛋白酶、 胰酶、 风味蛋白酶对天麻蛋白进行水解获得抗菌活性短肽, 不同蛋白酶水解氨基酸残是不同的, 例如: 胰蛋白酶主要水解赖氨酸和精氨酸; 胃蛋白酶主要水解芳香族氨基酸的N 端或C 端[3]。 不同蛋白酶水解获得的短肽具有不同的化学结构, 不同化学结构的短肽其有不同抗菌活性[4]。另外同一蛋白酶的不同水解条件获得的抗菌活性多肽存在差异, 导致抗菌活性存在差异[5], 因此, 对蛋白酶水解条件进行优化获得具有最强抗菌活性的最佳水解条件具有重要的科学价值。 胃蛋白酶是一种常见的蛋白酶, 国内外还鲜见其对天麻蛋白水解产物抗菌活性的报道。 本研究以胃蛋白酶水解从天麻中提取的天麻蛋白获得短肽, 考察胃蛋白酶水解天麻蛋白获得多肽是否具有更强的抗铜绿假单胞菌活性, 且多肽抗铜绿假单胞菌活性的最佳水解条件。 为天麻蛋白进一步的开发应用提供理论依据和技术方法。

1 实 验

1.1 材料与试剂

天麻: 采集于安徽亳州天麻种植户。 菌种: 铜绿假单胞菌标准株ATCC9027 保存安徽科技学院生命与健康科学学院药学系微生物学与免疫学实验室; 酶及蛋白质定量试剂: 胃蛋白酶, Bradford 蛋白浓度测定试剂盒均购于生工生物工程(上海)股份有限公司。 培养基: 营养肉汤和营养琼脂, 北京奥博星生物技术有限公司。

1.2 仪 器

FA21048 电子天平, 上海市精密科学仪器总厂;SpectraMax190 酶标仪, 美国MD 全波长酶标仪; 真空冷冻干燥机, 德国 Martin Christ 公司; 高速冷冻离心机, 美国 Thermo Fisher Scientific 公司; 酸碱 pH 计, 瑞士 Mettler Toledo 公司;LSHZ-300 恒温水浴振荡器, 太仓市华美生化仪器厂; MYP13-2S 磁力搅拌器, 上海梅颖浦公司; 恒温培养箱, 合肥右科设备有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 天麻蛋白的制备

天麻的鲜球茎用水洗净除去泥沙, 切成小块或薄片, 按料液比1∶8(g/mL)加入4 ℃预冷的生理盐水, 用绞肉机匀浆10 ~15 min 至浆糊状, 匀浆物用4 层纱布减压过滤, 收集滤液, 在冷冻离心机4 ℃ 5000 r/min 离心10 min, 用加样枪小心取上清液, 用量筒量测量体积, 把盛上清液的烧杯置于磁力搅拌器上搅拌, 边搅拌便加入硫酸铵, 最终加入硫酸铵的量达到70%(g/mL)饱和状态, 放置4 ℃冰箱(或冰浴)静置1 h 后,4 ℃5000 r/min 离心10 min 弃上清液, 沉淀物用生理盐水溶解, 加入透析袋中, 透析2 次除去硫酸铵, 把透析袋中的蛋白溶解在适量的PBS(pH=6)。 用Bradford 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度(按照试剂盒说明书的操作方法进行), 最终把蛋白质浓度调至2 mg/mL 后4 ℃贮存备用(不要超过3 天, 超过 3 天-20 ℃贮存)。

1.3.2 胃蛋白酶水解天麻蛋白

取1 mL 浓度为2 mg/mL 的天麻蛋白(pH=6)于2 mL 的离心管中, 加入0.2 mg/mL 的蛋白酶(pH=6)1 mL, 在37 ℃震荡水浴3 h 后, 在80 ℃温浴30 min 灭活蛋白酶。 检测胃蛋白酶水解天麻蛋白产物抗铜绿假单胞菌抗菌活性。

1.3.3 天麻蛋白与酶水解天麻蛋白产物多肽抗铜绿假单胞菌活性比较

牛津杯法检测抗菌活性: 将已灭菌的营养琼脂培养基(琼脂培养基的配制方法: 33.0 g 琼脂培养基加入1000 mL 蒸馏水中, 煮沸溶解, 121 ℃灭菌15 min)趁热把15 mL 琼脂培养基倒入直径为9 cm 的灭菌培养皿中。 待琼脂培养基凝固后, 取用肉汤培养基培养(肉汤培养基的配制方法: 18 g 肉汤培养基溶解在1000 mL 蒸馏水中, 115 ℃灭菌30 min)OD600的吸光度值为0.1 对数生长期的铜绿假单胞菌50 μL 均匀涂布在固体培养基上。 在上面均匀放置牛津杯9 个, 3 个里面加入天麻蛋白溶液25 μL+蒸馏水25 μL, 3 个里面加入天麻蛋白酶水解多肽液50 μL(含天麻蛋白溶液25 μL+胃蛋白酶25 μL), 3 个里面加入胃蛋白酶25 μL+蒸馏水 25 μL。 在恒温培养箱中 37 ℃培养18 ~24 h。 用游标卡尺测抑菌圈的大小, 每个抑菌圈从不同方向测3 次求平均值。

1.3.4 单因素条件的确立

酶对蛋白水解影响的主要因素是水解温度、 水解时间和pH 值。 本研究以抑菌圈大小为指标, 首先对上述三单因素进行考察, 在获得最佳单因素条件后, 设计正交实验, 确立天麻蛋白水解物具最强抗铜绿假单胞菌的水解条件。

1.3.5 天麻蛋白酶水解产物多肽对铜绿假单胞菌抗菌活性的单因素考察

1.3.5.1 蛋白酶水解温度对水解产物多肽抗菌活性的影响

取5 支2 mL 的离心管, 分别加入1 mL 浓度为2 mg/mL 的天麻蛋白(pH=6)和0.2 mg/mL 的蛋白酶(pH=6)1 mL, 在17 ℃、 27 ℃、 37 ℃、 47 ℃、 57 ℃震荡水浴 3 h 后, 在 80 ℃温浴30 min 灭活蛋白酶。 检测水解产物多肽抗铜绿假单胞菌抗菌活性, 每个实验做三次求平均值。

1.3.5.2 蛋白酶水解时间对水解多肽产物抗菌活性的影响

取5 支2 mL 的离心管, 分别加入1 mL 浓度为2 mg/mL 的天麻蛋白(pH=6)和0.2 mg/mL 的蛋白酶(pH=6)1 mL, 在37 ℃震荡水浴 1 h、 2 h、 3 h、 4 h、 5 h 后, 在 80 ℃ 温浴30 min 灭活蛋白酶。 检测水解产物多肽抗铜绿假单胞菌抗菌活性, 每个实验做三次求平均值。

1.3.5.3 蛋白酶水解pH 对水解产物多肽抗菌活性的影响

取5 支2 mL 的离心管, 分别加入1 mL 浓度为2 mg/mL 的天麻蛋白(pH=3、 pH=4、 pH=5、 pH=6、 pH=7)和 0.2 mg/mL的蛋白酶(pH=3、 pH=4、 pH=5、 pH=6、 pH=7)1 mL, 在37 ℃震荡水浴3 h 后, 在80 ℃温浴30 min 灭活蛋白酶。 检测水解产物多肽抗铜绿假单胞菌抗菌活性, 每个实验做三次求平均值。

1.3.6 正交实验设计

以1.3.5 单因素实验结果为依据, 选取水解产物多肽具有较强抗铜绿假单胞菌活性的蛋白酶水解条件的3 因素水平, 进一步设计3 因素3 水平正交试验, 通过试验获得天麻蛋白水解产物多肽最强抗铜绿假单胞菌活性水解工艺条件。 因素水平如表1 所示, 正交试验结果如表2 所示。

2 结果与讨论

2.1 天麻蛋白与水解产物抗菌活性比较

根据1.3.2 和1.3.3 的试验, 天麻蛋白和天麻蛋白经蛋白酶对天麻蛋白水解的产物多肽对铜绿假单胞菌的抑菌圈大小分别为6.32 mm 和16.15 mm(牛津杯的直径约6 mm), 胃蛋白酶对铜绿假单胞菌没有抑菌活性, 没有抑菌圈产生。 试验结果说明: 天麻蛋白对铜绿假单胞菌抑菌活性很小。 但天麻蛋白经胃蛋白酶水解成多肽后其抗铜绿假单胞菌活性明显增强。 因此,可以进一步进行天麻蛋白经胃蛋白酶水解产物抗铜绿假单胞菌最佳水解工艺研究。

2.2 单因素试验的结果

2.2.1 酶水解温度对水解产物多肽抗铜绿假单胞菌活性的影响

温度对胃蛋白酶水解天麻蛋白的产物多肽抗铜绿假单胞菌活性的影响如图1 所示。 酶解温度从17 ℃到37 ℃时随着水解温度的升高水解产物多肽对铜绿假单胞菌的抗菌活性逐渐增强, 当酶水解温度从37 ℃到57 ℃时, 水解产物多肽对铜绿假单胞菌的抗菌活性没有增强反而有所减小。 原因可能是胃蛋白酶水解蛋白的最佳温度是37 ℃左右, 随着温度的不断升胃蛋白酶活性逐渐失活, 水解天麻蛋白活性逐渐降低。 因此, 天麻蛋白水解产物多肽具有较好抗幽门螺杆菌活性的水解温度为37 ℃。

图1 温度对天麻蛋白水解产物多肽抗菌活性的影响Fig.1 Effect of temperature on antimicrobial activity of peptides from Gastrodiaelata protein hydrolysate

2.2.2 酶水解时间对水解产物多肽抗铜绿假单胞菌活性的影响

时间对胃蛋白酶水解产物多肽抗铜绿假单胞菌活性的影响如图2 所示。 酶水解时间从1 h 到3 h 时随着胃蛋白酶水解时间的延长水解产物多肽抗铜绿假单胞菌活性逐渐增强, 当水解时间从3 h 至4 h 时, 天麻蛋白水解产物多肽抗铜绿假单胞菌活性, 没有明显变化。 但从4 h 至5 h 时, 天麻蛋白水解产物多肽抗铜绿假单胞菌活性, 没有增强反而有所减小, 可能蛋白酶在水解3 h 至4 h 时水解天麻蛋白获得的多肽成分具有强的抗铜绿假单胞菌活性, 4 h 后随着水解时间的延长, 其最强抗菌成分多肽被蛋白酶非特异性降解破坏成无活性的水解产物。因此, 天麻蛋白水解产物多肽具有较好抗幽门螺杆菌活性的水解时间为3 h。

图2 时间对天麻蛋白水解产物多肽抗菌活性的影响Fig.2 Effect of time on antimicrobial activity of peptides from Gastrodiaelata protein hydrolysate

2.2.3 酶水解pH 对水解产物多肽抗铜绿假单胞菌活性的影响

pH 对胃蛋白酶水解产物多肽抗铜绿假单胞菌活性的影响如图3 所示。 pH 从1 到1.5 时胃蛋白酶水解产物多肽抗铜绿假单胞菌活性逐渐增强, pH 从1.5 到2 时胃蛋白酶水解产物多肽抗铜绿假单胞菌活性抗菌活性增加不明显, 当pH 值大于2 后,天麻蛋白水解产物多肽的抗菌活性并没有增强反而有所减小,可能与胃蛋白酶水解的最适pH 是1.5 ~2.0 有关, 当水解pH=2 时胃蛋白酶对天麻蛋白的酶解活性最强。 因此, 天麻蛋白水解产物多肽具有较好抗幽门螺杆菌活性的水解pH 是2。

图3 pH 对天麻蛋白水解产物多肽抗菌活性的影响Fig.3 Effect of pH on antimicrobial activity of peptides from Gastrodiaelata protein hydrolysate

2.3 正交试验设计与结果

2.3.1 正交试验因素和水平确立

根据单因素获得抑制尿素酶活性的浸提因素的浸提条件,设计下列正交试验各因素水平如表1 所示。

表1 正交试验各因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2.3.2 正交试验结果

按照1.3.3 试验方法测得天麻蛋白胃蛋白酶水解产物多肽对铜绿假单胞菌抑菌圈的大小, 根据单因素试验结果确立的3因素和3 水平进行正交试验(表1), 测得水解产物多肽对铜绿假单胞菌的抑制圈正交试验结果如表2 所示。 从表2 正交试验结果可以看出: 三个因素的极差R 可知3 因素中A 因素温度对水解产物多肽抑菌活性影响最大, 水解时间B 因素对水解产物多肽抑菌活性影响最小, 其次C 因素酸碱度pH 对水解产物多肽抑菌活性影响较大。 天麻蛋白被胃蛋白酶水解产物多肽对铜绿假单胞菌具最强抑制活性的组合是A2B3C3, 即酶水解温度37 ℃, 酶水解时间为4 h 及酶水解酸碱度pH 为2.5 的水解条件获得的天麻水解产物多肽抗铜绿假单胞菌的活性的活性最强。 但水解最佳组合条件A2B3C3不存在于正交试验表中, 因此, 需进一步做验证试验, 以A2B3C3酶水解条件进行3 次水解产物多肽铜绿假单胞菌抑菌活性试验抑菌圈大小为17.25 mm大于正交试验表中的最大抑菌圈16.67 mm, 说明正交试验获得的最佳条件组合是正确的。

表2 水解产物多肽抗菌活性(抑菌圈)正交试验结果Table 2 The results of orthogonal test of antibacterial activity(inhibition zone) for hydrolysate peptides

3 结 论

文献报道: 天麻具有多种药理作用, 具有益智作用、 脑保护作用、 镇痛作用、 镇静催眠作用、 抗癫痫作用、 抗晕眩作用、 降压作用、 降血脂作用、 抗氧化作用、 保肝作用、 抗肿瘤作用、 增强免疫力作用等[6]。 天麻中含有多种化学成分其中含有抗真菌蛋白成分[7]。 并且科研工作者对抗真菌蛋白进行了深入研究[8-11]。 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种引起人类机会性感染的普遍存在的革兰阴性细菌, 并且在临床出现抗生素抵抗菌株[12]。 这给临床治疗带来困难和挑战。 必须寻求新的抗菌物质, 其中抗菌活性的多肽就是一种值得研究的候选物。 因其抗菌机制不同于抗生素主要通过破坏细菌细胞膜结构完整性, 增加细胞膜渗透性达到杀菌作用, 细菌不易产生耐药性[13]。 本研究证实: 天麻蛋白经胃蛋白酶水解后的产物多肽具有抗铜绿假单胞菌活性。 但天麻蛋白水解产物多肽抗铜绿假单胞菌活性受水解时间、 水解温度和水解液的酸碱度pH 等因素的影响。 其最佳抗菌活性的水解条件是酶水解温度37 ℃, 酶水解时间为4 h 及酶水解酸碱度pH 为2.5。 本研究证实利用酶法水解蛋白可以获得具有抗菌活性的多肽, 为将来水解蛋白可以获得具有抗菌活性多肽途径及天麻蛋白的进一步开发利用提供理论依据和技术方法。 但天麻蛋白胃蛋白酶水解产物抗菌活性的多肽的结构和其抗铜绿假单胞菌的抗菌机制有待进一步研究。