星毛冠盖藤乙酸乙酯部位抗三阴乳腺癌的研究∗

石雅倩, 耿梦丽, 李红娜, 黄思源, 李丽霞, 黄 怡, 钟一真, 欧叶涛

(1 桂林医学院基础医学院, 广西 桂林 541004; 2 新乡医学院三全学院基础医学院, 河南 新乡 453003)

三阴乳腺癌是一种雌激素(ER)、 孕激素(PR)以及人表皮生长因子受体2(HER-2)表达均呈阴性的乳腺癌的特殊亚型,具有高侵袭性、 高转移潜能、 易复发、 预后差的特点, 一直是乳腺癌临床治疗中的重点和难点, 目前仍十分缺乏有效的治疗手段和药物[1]。 天然植物抗肿瘤具有靶点多样、 毒副作用小的明显优势[2]。 星毛冠盖藤(Pileostegia Tomentella Hand. -Mazz.), 又名肿瘤藤、 消瘤藤[3], 是一味传统的瑶族常用中草药, 具有显著的抗癌作用, 而目前十分缺乏对其药理机制的报道。 本研究探讨星毛冠盖藤乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of Pileostegia tomentella, PTE)对三阴乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响, 以细胞MDA-MB-231 为研究对象, 运用MTT 方法检测并计算PTE 抑制细胞增殖的最佳作用时间和IC50, 选取合适的时间和剂量处理细胞后, 台盼蓝染色法明确PTE 的杀伤作用, TUNEL 方法检测细胞凋亡情况, Western blot 检测细胞内凋亡相关蛋白的表达情况。 综合评价PTE 的抗三阴乳腺癌效果, 为星毛冠盖藤的开发利用提供理论依据, 促进民族医药的发展。

1 实 验

1.1 材 料

(1)试验药物: 星毛冠盖藤采于广西金秀地区(金秀县罗香乡白牛村, 北纬23.958411 度, 东经110.225487 度, 定位 K 码8vqs4kdch, 海拔高度547 米), 经广西壮族自治区中国科学院植物研究所黄俞淞研究员鉴定为药用星毛冠盖藤全草。

(2)人三阴乳腺癌MDA-MB-231 细胞, 美国 ATCC 细胞库; 四氮唑蓝(MTT)、 台盼蓝染液, 碧云天生物技术公司;TUNEL 试剂盒, 江苏凯基生物技术股份有限公司; Caspase-3抗体, CST 公司; 环磷酰胺, MCE 公司; 真空冷冻干燥机, 宁波新芝生物科技股份有限公司; 旋转蒸发仪, 德国IKA 公司;多功能酶标仪, TECAN 公司; 正置、 倒置荧光显微镜, 德国徕卡有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 药物提取

取星毛冠盖藤的藤茎, 阴干后粉碎, 过50 目筛, 取药材粉末300 g, 分别用75%、 85%、 95%、 95%、 95%乙醇各超声提取一次, 液料比(mL/g)8∶1, 40 kHz, 40 min/次。 0.22 μm微孔滤膜过滤, 合并滤液, 浓缩得总提物, 留样后用水混悬,乙酸乙酯(分析纯)萃取, 合并滤液后浓缩得乙酸乙酯部位提取物(PTE), 冷冻干燥机冻干后, 4 ℃保存备用。

1.2.2 四氮唑蓝(MTT)比色实验

细胞增殖率检测: 乳腺癌细胞MDA-MB-231 以3×103/孔接种于96 孔板中, 不同剂量的PTE 处理细胞, 2.8 mg/mL 的环磷酰胺处理为阳性对照, 阴性对照组不加药, 空白组只加培养液(不种细胞), 每组6 个重复孔。 继续培养24 h、 48 h、 72 h后加MTT, 孵育箱内避光培养4 h 后, 多功能酶标仪检测各组在490 nm 处的吸光度, 计算细胞增殖活性。 药物对细胞的抑制率=1-(实验-空白)/(阴性-空白)×100%。

1.2.3 台盼蓝染色实验

细胞死亡率检测: MDA-MB-231 细胞PTE 处理后48 h 收集细胞, 调整至适当浓度, 台盼蓝染色3 min, 细胞计数板上观察, 拍照、 计数、 计算细胞死亡率。 细胞死亡率=死细胞数/总细胞数×100%。

1.2.4 TUNEL 法检测细胞凋亡

乳腺癌细胞MDA-MB-231 以2×104/孔接种于24 孔板细胞爬片上(多聚赖氨酸包被), PTE 处理后 48 h 检测。 根据TUNEL 试剂说明书处理样本, 固定、 通透、 TdT 酶标记、Streptavidin-Fluorescein 标记、 DAPI 复染、 封片观察。

1.2.5 Western blot 检测蛋白表达

乳腺癌细胞MDA-MB-231 以90×104/皿接种于10cm 灭菌培养皿中, 次日加药PTE 500 μg/mL, 48 h 后提取总蛋白。 运用12%的SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白; 200 mA, 1.5 h 转膜至0.22 μm 的PVDF 膜上, 5%脱脂奶粉封闭, 一抗(1∶1000)孵育过夜(4 ℃, 约16 h); 次日回收抗体, 二抗(1∶10000)孵育1 h, 洗膜成像。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0 统计分析软件处理数据, 不同剂量给药组间抑瘤率比较采用单因素方差分析, 两组间比较用独立样本t检验, 当p<0.05 时差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 药物提取

300 g 药材粉末, 超声乙醇提取, 浓缩后得总提物22 g; 乙酸乙酯萃取, 浓缩后得乙酸乙酯提取物5.4 g。

2.2 PTE 对乳腺癌MDA-MB-231 细胞增殖的影响

MTT 结果显示, 经PTE 处理后24 h, 细胞增殖活性有一定降低; 加药后48 h, 细胞密度明显下降, 形态明显异常, 增殖活性降低, 且呈明显的剂量依赖性; 加药后72 h, 细胞增殖依然被抑制, 但与加药后48 h 的抑制效果差异不大(见图1、图2)。 由此表明: PTE 对MDA-MB-231 具有明显的抑增殖作用, 48 h 时抑制作用已接近平台期, 此时的IC50为503.4060±4.9686 μg/mL。 因此, 本实验选取 500 μg/mL、 48 h 为处理条件, 继续下一步的研究(详细IC50见表1)。

图1 PTE 对MDA-MB-231 增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of PTE on proliferation of MDA-MB-231

图2 细胞形态学观察Fig.2 Cell morphology

表1 星毛冠盖藤乙酸乙酯提取物对乳腺癌细胞的IC50Table 1 IC50 of ethyl acetate extract of Pileostegia tomentella on breast cancer cells

2.3 PTE 对乳腺癌MDA-MB-231 细胞的杀伤效果

PTE 500 μg/mL 处理细胞, 48 h 后进行台盼蓝染色。 结果显示: 每个样本, 即4 个计数大格细胞总数约600 ~800 个, 其中阴性组死细胞约40 ~50 个, PTE 组死细胞约300 ~350 个,阴性组死亡率3.87%, PTE 组细胞死亡率42.99%(见图3),提示PTE 对乳腺癌细胞具有明显的杀伤作用。

图3 台盼蓝染色结果Fig.3 Results of Trypan blue staining

2.4 PTE 对乳腺癌MDA-MB-231 细胞凋亡的影响

PTE 500 μg/mL 处理细胞, 以2.8 mg/mL 的环磷酰胺处理做阳性对照, 阴性对照组不做任何处理, 48 h 后进行TUNEL染色。 结果显示, 阴性对照组未出现绿色荧光, PTE 组和环磷酰胺组检测到明显绿色荧光颗粒。 结果提示: PTE 可以诱导乳腺癌细胞发生凋亡(见图4)。

图4 TUNEL 染色结果Fig.4 Results of TUNEL

2.5 PTE 对乳腺癌MDA-MB-231 细胞中Caspapse-3 表达的影响

PTE 500 μg/mL 处理细胞, 48 h 后提蛋白检测。 结果显示,PTE 显著激活了Caspase-3(见图5), 这表明Caspase-3 参与了PTE 诱导MDA-MB-231 细胞凋亡的过程。

图5 Western blot 检测 MDA-MB-231 加药 48 h 后Caspase-3 的表达情况Fig.5 MDA-MB-231 Cells were treated withPTE (500 μg/mL)for 48 h, the expressions of Pro-Casp-3were deteted by Western blot

3 结 论

星毛冠盖藤, 是虎耳草科冠盖藤属植物[4], 主要化学成分包括黄酮类、 苷类、 香豆素类、 萜类、 芳香类等[5], 具有抗氧化、 抗肿瘤的生物活性[6]。 目前, 关于星毛冠盖藤的研究仅有少数几篇文献报道, 且大多集中于化学成分的研究以及提取技术的优化, 缺乏对其抗肿瘤药理的报道。 此外, 由于三阴乳腺癌中缺乏ER、 PR、 HER-2 的表达, 其对内分泌治疗和HER-2靶向治疗并不敏感, 目前十分缺乏科学有效的治疗手段。 因此, 本研究选取三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231 作为研究对象,探究星毛冠盖藤乙酸乙酯部位对其增殖及凋亡的影响。

MTT 比色法是常用的细胞活性检测技术, 一般用于大规模的抗肿瘤药物筛选[7], 但其只能反映细胞的存活状态, 无法鉴别细胞的增殖抑制与死亡。 因此, 本研究运用MTT 与经典的台盼蓝染色技术相结合的方法[8], 对PTE 的作用进行双向验证,结果发现: PTE 对三阴乳腺癌MDA-MB-231 细胞的增殖活性具有显著的剂量依赖性抑制作用。 明场显微镜下观察可见: 与阴性组相比, 药物处理后的细胞密度明显下降, 形态不再是平滑的梭形, 而呈异常的球形, 明显皱缩, 细胞间连接减少。 同时, 台盼蓝结果显示, 加药后的细胞死亡率显著增高。 由此可见, PTE 对MDA-MB-231 细胞具有抑增殖、 促死亡的双重作用。 与我们的研究结果一致, 王云卿[9]、 谢金攀[10]等人报道,星毛冠盖藤总提取物和石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇等部位萃提物可有效抑制肝癌、 宫颈癌细胞的增殖活性, 都肯定了星毛冠盖藤的抗癌效果。

凋亡是细胞程序性死亡的主要方式, 与肿瘤的发生发展密切相关[11]。 本实验对三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231 进行了凋亡相关的研究。 运用TUNEL 染色法对加药后的细胞样本进行了检测, 结果发现: PTE 组样本中可见明亮的绿色荧光颗粒,提示细胞发生了凋亡。 同时, PTE 加药后48 h, Caspase-3 前体表达降低, 提示PTE 可以导致MDA-MB-231 细胞中Caspase-3的激活。 由此可见, PTE 能显著抑制三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231 的增殖活性并诱导其发生凋亡, 其生理机制与Caspase-3的激活有关。 Caspase-3 是细胞凋亡的执行蛋白, 在药物诱导乳腺癌细胞发生凋亡的过程中发挥着至关重要的作用[12], 有研究表明, 星毛冠盖藤乙酸乙酯萃取物可以通过介导ROS 的产生来诱导肺癌细胞H1299 发生Caspase 依赖的凋亡, 从而发挥抗癌作用[13]; 总香豆素部位可以显著抑制结肠癌细胞HT-29 的增殖、 克隆、 迁移和侵袭能力, 还能显著下调细胞中Bcl-2 和NF-κB 的蛋白表达, 激活 Caspase-3 , 促进细胞凋亡[14]。 这提示我们, 在PTE 激活Caspase-3, 诱导乳腺癌细胞凋亡的过程中, 可能会有 ROS、 Bcl-2、 NF-κB 以及 Caspase-3 等分子的参与, 具体的分子生物学机制尚需进一步的深入探讨。