尿酸氧化酶固定化应用于高尿酸血症研究进展

汪志伟，任梦飞，夏觅真，吴琳梅

尿酸氧化酶固定化应用于高尿酸血症研究进展

汪志伟，任梦飞，夏觅真，吴琳梅

（安徽医科大学 生命科学学院，安徽 合肥 230032）

高尿酸血症是严重影响身体健康和生活质量的一大疾病．尿酸氧化酶（UOX）能够催化尿酸生成水溶性尿素囊，从而降低尿酸水平，起到治疗高尿酸血症的作用．但是，UOX作为一种外源性蛋白质，存在体内稳定性低、半衰期短、抗原性强、治疗价格高等问题，限制了其在临床上的使用．通过酶的固定化技术，可以克服UOX的缺点，扩大其在治疗高尿酸血症上的应用．对UOX的固定化及其应用于高尿酸血症的相关研究进行综述，旨在为UOX类药物开发提供参考．

高尿酸血症；尿酸氧化酶；固定化酶；载体材料

高尿酸血症是嘌呤代谢紊乱引起的代谢异常综合征，指在正常的嘌呤饮食状态下，无论男女，非同日2次血尿酸水平超过420 µmol/L（7 mg/dL）[1]．近年来，随着生活方式的改变，我国高尿酸血症的发病率明显上升且呈年轻化趋势．研究显示，我国成人高尿酸血症的患病率高达13.3%，约有1.7亿高尿酸血症患者[2]．因此，高尿酸血症已经成为严重影响我国居民身体健康和生活质量的一大疾病，有效降低体内尿酸水平是治疗高尿酸血症的关键．尿酸是嘌呤化合物代谢的最终产物，主要以尿酸盐阴离子的形式存在于循环中．人体内的尿酸约2/3经肾脏排泄，1/3经胆道和肠道排泄[3]．在正常生理和嘌呤饮食状态下，尿酸的产生和排泄保持动态平衡，当其代谢平衡被打破则导致高尿酸血症的发生．目前，治疗高尿酸血症的药物有３大类[4-8]．但相关药物都存在一些弊端，如丙磺舒、苯溴马隆可引起尿酸盐晶体在尿路的沉积，导致肾绞痛和肾功能损害[7]438；非布索坦有较高的心血管事件发生率[9]．因此，研发疗效好、副作用小的治疗高尿酸血症的新药迫在眉睫．

尿酸氧化酶（Urate oxidase，UOX）是一种在嘌呤代谢途径中催化尿酸氧化的酶，其可将尿酸催化氧化生成惰性水溶性嘌呤代谢物——尿素囊，从而达到降低尿酸的目的．但是，在灵长类动物漫长的进化过程中，人的UOX基因编码33和187位精氨酸密码子无义突变成终止密码子，故人体不能合成有活性的UOX[10]．因此，外源性UOX在治疗高尿酸血症上的价值受到了国内外学者的广泛关注．目前，已经商业化的UOX已历经３代发展：第１代UOX制剂又称非重组酶制剂，如由Sanofi Winthrop公司生产并在法国上市的UOX制品uricozyme[11]；第２代重组UOX，如由Sanofi-Synthelabo公司开发的rasburicase[12]；第３代聚乙二醇修饰的重组UOX，如2010年FDA批准的pegloticase[13]．虽然，UOX作为分解尿酸的生物制剂已被批准上市，但是UOX作为一种外源性蛋白质，存在易被体内酶水解、稳定性低、半衰期短等蛋白质药物的共同缺点[14]，除此之外，UOX药物存在价格高昂，抗原性较强，易产生过敏反应等问题，极大地限制了UOX在临床上的使用[15]．

近年来，随着现代生物技术的不断发展以及学科间的相互渗透，大量研究发现通过将UOX固定化，可以克服上述缺点，扩大其在治疗高尿酸血症上的应用．与游离酶相比，固定化酶不易被体内或体外的蛋白酶分解，半衰期延长，而且能大大降低酶的免疫原性[16]．因此，本文综述了固定化UOX在治疗高尿酸血症中的应用，为UOX药物的研发提供一定的参考．

1　固定化方法

传统的固定化技术主要分为吸附、共价结合、包埋和交联4大类[17]189．除此之外，UOX的固定化还出现了一些新方法．

1.1　逆向蒸发法固定化

逆向蒸发法固定化方法主要是将磷脂等膜材料溶于有机溶剂（如氯仿）中，再旋转蒸发挥发有机溶剂得到薄膜．薄膜通过有机溶剂（如乙醚）再分散，然后加入含有UOX的溶液，二者混合后进行超声，直到形成稳定油包水乳状液，减压蒸发除去有机溶剂，得到固定化的UOX．目前，逆向蒸发法主要用于制备脂质体固定的UOX[18-21]．

1.2　复乳法固定化

复乳法固定化方法先将磷脂材料溶于适量的有机溶剂中得到油相（O），内水相（W）主要是含有UOX的水溶液，将内水相与油相按照一定体积混合均匀，形成W/O型初乳．再将初乳加入到外水相溶液中，二者混合后，在高速分散均质机快速剪切形成复乳，将复乳置于旋转蒸发仪中除去有机溶剂，最终得到固定化的UOX[22]．

1.3　纳米花型杂交晶体固定化

纳米花型固定化酶指的是酶分子直接与无机盐晶体杂交形成具有类似天然花卉形态结构的复合体，通过一步法获得固定化酶的技术手段[17，23]．如在无机磷酸氢钙形成的过程中引入UOX，得到纳米花固定化UOX[24]952．

2　固定化载体的选择

2.1　脂质体固定尿酸氧化酶

脂质体主要由磷脂和胆固醇组成，结构类似于生物膜的囊泡[25]．脂质体固定UOX呈类球形，且当磷脂与胆固醇的摩尔比为1∶1时，UOX的包封率最大[19]29．体内尿酸清除研究表明，尾静脉注射脂质体固定UOX约9 h后，模型鼠体内尿酸下降到正常水平；较游离UOX而言，缩短了4倍用时．值得一提的是，脂质体进行修饰后再固定化UOX，可实现多组分协同治疗．如透明质酸修饰的脂质体固定UOX[26-27]，能够起到降低尿酸和抗炎的作用．

2.2　聚合物固定尿酸氧化酶

早期，天然多糖高分子聚合物被应用于UOX的固定化．如UOX固定于交联羧甲基淀粉表面[28]．近年来，合成聚合物在固定UOX展现一定潜能．ZHANG X[29]等将UOX丙烯酰化，并以其为“核”，然后以N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）作为自由基聚合，单体N，N'-亚甲基双丙烯酰胺（BIS）作为交联剂，得到核壳结构固定化酶UOX/PVP．相对于游离UOX而言，UOX/PVP在血液中的循环时间提高了10倍；尾静脉注射UOX/PVP（25 U/kg）1 d后，高尿酸模型鼠血清尿酸浓度由（1 600±5）μmol/L降为（225±63.7）μmol/L．

嵌段共聚物（Pluronic，NC）是一类具有多种作用的有效药物递送系统，其形成的胶束体系能够有效装载各种生物大分子和金属纳米材料[30]．Kim[31]等将UOX和金纳米颗粒（AuNP）共同包封到NCs中，得到UOX-AuNP@NCs，UOX的装载效率超过90%．体外实验表明，UOX-AuNP@NCs降解的尿酸量显著增加，在高尿酸血症小鼠模型中表现出了更长的血清半衰期．

2.3　自组装空心纳米微球固定尿酸氧化酶

自组装空心纳米微球（UHPHD）是一种新型的载体，酶可包载于空心纳米囊中，从而实现固定化．邓雪[32-33]等将UOX装载于聚乙二醇-透明质酸/磺丁基--环糊精形成的UHPHD中，并对其药代动力学和生物等效性初步研究．结果表明，游离UOX的半衰期为（0.89±0.25）h，UHPHD固定UOX的半衰期为（8.35±5.95）h，延长了8.4倍，固定化UOX的生物利用度和抗胰蛋白酶水解能力增强．

2.4　纳米花固定尿酸氧化酶

纳米花型固定化酶只需一步反应便能完成载体合成及酶的固定化，具有极大的发展和应用潜力[34]．Hao Y[24]等利用纳米花型态的无机磷酸氢钙共固定UOX和辣根过氧化物酶（HRP），得到UOX&HRP-CaHPO4，并采用微针系统将其递送到高尿酸血症模型鼠体内．结果表明，9 h后血清尿酸可降到正常水平．UOX催化尿酸氧化生成尿囊素、CO2和H2O2．然而，大量H2O2在人体内会引起严重的副作用．UOX&HRP-CaHPO4实现降低尿酸的同时通过HRP催化作用清除生成的H2O2．

2.5　水凝胶固定尿酸氧化酶

水凝胶是以水为分散介质的，具有三维空间网络结构的体系，在酶的固定化上应用广泛．Cho[35]等设计了一种由聚乙二醇-聚（-氨基酯聚氨酯）（PEG-PAEU）共聚物组成的含白蛋白结合肽（ABP）的可注射水凝胶，用于固定人血清白蛋白（HSA）修饰的UOX（UOX-HSA），并利用水凝胶结构中HSA与ABP之间的强特异性相互作用来延长酶的释放．结果表明，PEG-PAEU-ABP固定UOX-HSA半衰期约为96 h，较游离UOX提高了88倍．

3　结语

UOX通过固定化后，其稳定性、半衰期、生物利用率等得到了很大的提高，同时外源蛋白质引起的免疫原性降低．固定化载体材料从天然聚合物发展到脂质体、纳米花和水凝胶．通过透皮给药方式治疗可以选择水凝胶固定UOX；聚合物、脂质体、纳米花对固定UOX展现出较高的包封率和酶活，但是作为治疗性固定化酶，其生物安全性评价还有待系统地研究．未来固定化UOX的研究可以考虑２个方面：（1）目前固定化UOX主要是通过静脉注射的方式给药，作用部位在肝脏和肾脏，长期的药物治疗会引起肝肾功能损伤．鉴于尿酸在肠液中有较高的分布，通过肠道途径降低血尿酸具有可行性[36]．但是，UOX在偏酸性条件下活性较低．因此，可通过固定化技术，提高UOX在酸性条件下酶活性，为口服UOX类制剂的研发提供新方向．（2）载体材料进行功能化的修饰，构建多酶体系结合的固定化酶，同时发挥载体与酶以及不同酶之间的协同作用．

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Research progress on immobilization of urate oxidase and its application in hyperuricemia

WANG Zhiwei，REN Mengfei，XIA Mizhen，WU Linmei

（School of Life Sciences，Anhui Medical University，Hefei 230032，China）

Hyperuricemia is a major disease that seriously affects health and quality of life．Urate oxidase（UOX）can treat hyperuricemia because that it can catalyze enzymatic oxidation of uric acid to allantoin，which reduce the level of plasma uric acid．However，as an exogenous protein，UOX has the problems，such as low in vivo stability，short half-life，strong antigenicity and high treatment price，which limit its clinical use．Through the enzyme immobilization technology，the shortcomings of UOX can be overcome and its application in the treatment of hyperuricemia can be expanded．The immobilization of UOX and the related researches on its application in hyperuricemia were reviewed in order to provide reference for the development of UOX drugs．

hyperuricemia；urate oxidase；immobilized enzyme；carrier materials

1007-9831（2022）11-0063-04

Q814

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2022.11.012

2022-04-29

安徽医科大学博士科研基金项目（XJ201515）; 安徽医科大学2021年大学生创新创业训练计划项目（202110366046X）

汪志伟（2001-），男，安徽池州人，在读本科生．E-mail：wangzhiwei202109@163.com

吴琳梅（1988-），女，贵州三都人，讲师，博士，从事生物材料研究．E-mail：wlm88.1.26@126.com