不同秋眠型苜蓿顶芽中特异表达蛋白筛选及其功能鉴定

杜红旗， 娄治国， 邹 靖， 房卫平， 冯长松*

(1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州450002； 2.河南省农业科学院经济作物研究所， 河南 郑州 450002；3.河南省信阳市畜牧工作站， 河南 信阳464000)

秋眠性是指从夏末至秋季由于日照长度缩短和温度下降，紫花苜蓿(MedicagosativaL.)植株表现为缓慢匍匐生长或停止生长的一种特性。根据苜蓿秋眠特定时期刈割后植株的再生高度，将其分为秋眠型苜蓿、半秋眠型苜蓿、非秋眠型苜蓿和极不秋眠型苜蓿[1-3]。在秋季，秋眠型苜蓿生长变缓慢、叶变小、茎变纤细，但具有较强的抗寒性和高的越冬率；相反，非秋眠型和极不秋眠型苜蓿在秋季依然生长旺盛，但抗寒性差[4-5]；半秋眠型苜蓿介于二者之间。

关于苜蓿秋眠性的发生机理开展了大量研究。目前普遍认为调控紫花苜蓿秋眠性的主要环境因子是光周期和温度[6-7]，其中光周期是诱导秋眠性的关键因子[8]。苜蓿根系的生长状态、根系和根颈中可溶性糖的积累以及根和芽中氮素化合物的分解代谢可能参与苜蓿秋眠的发生[9-13]，苜蓿秋眠性与抗寒性呈显著正相关关系，但是二者是两个独立性状，苜蓿秋眠性与其适应性和生产性能有较大关系[14-16]，并且认为光敏色素、隐花色素2B、脱落酸、生长素等可能参与秋眠性的调控[8，17]。在苜蓿秋眠分子机理研究方面，2000年Douglas等人确定了控制秋眠型苜蓿秋季生长的基因组区域，但是该区域具体的核苷酸序列还未知[18]。王成章等应用高通量测序技术得到了大量的调控苜蓿秋眠的候选基因、蛋白和microRNAs，并且选出了重要候选调控基因和蛋白[19-22]。

高通量分析技术是基于计算在每个样本中均检测到的基因和蛋白相对含量来筛选样本间差异基因和蛋白，这样会遗漏一组样本中特异性表达而在其它组样本中不表达的基因和蛋白，也可能遗漏一组样本中高表达而在其它组样本痕量表达(通量分析技术检测不到)的基因和蛋白，因此为弥补这些遗漏，本研究通过检测秋眠1级苜蓿‘Maverick’和9级苜蓿‘Cuf101’顶芽中的蛋白在对方蛋白质组中是否存在来筛选各自特异表达的蛋白，应用荧光定量PCR技术检测春夏秋季两种苜蓿顶芽中蛋白mRNA相对表达量,了解其特异表达情况，以及通过建立特异表达蛋白过表达和沉默转基因植株观察其表型变化研究它们在苜蓿生长和秋眠中的作用。本研究丰富了苜蓿秋眠性理论，也为苜蓿分子育种提供功能基因和理论基础。

1 材料与方法

1.1 秋眠时期‘Maverick’和‘Cuf101’顶芽中特异性表达的蛋白筛选

基于前期秋眠时期‘Maverick’和‘Cuf101’顶芽蛋白质组结果[22]，将秋眠1级苜蓿‘Maverick’的3个样品的中蛋白进行两两比较，取两两比较的交集作为其蛋白集合(‘Maverick’的3个样品中至少有2个样品中存在的蛋白)；同理，对秋眠9级苜蓿‘Cuf101’的3个样品也分别进行两两比较，取两两比较的交集作为其蛋白集合；然后对两个蛋白集合进行比较得到它们各自特有蛋白。

1.2 RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR

在2015年7月8日、18日、28日，8月7日、18日，9月1日、12日、23日取美国苜蓿标准秋眠1级品种‘Maverick’和秋眠9级品种‘Cuf101’顶芽，每5株苜蓿作为一个生物学重复，7月8日、18日、28日取样在一个生长期内(C1)，8月7日、18日取样在一个生长期内(C2)，9月1日、12日、23日取样在一个生长期内(C3)。所有样品取样后立刻放于液氮中，到实验室储存于-80℃冰箱[22]。

根据特有蛋白和内参基因gapdh基因序列,应用primer5.0软件按照荧光定量引物设计原则设计它们的荧光定量引物(表1)，样品总RNA按照植物提取试剂盒操作说明(Takara Bio,Inc.)提取，应用Nano2000核酸检测仪器(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)检测各样品RNA的浓度，并调至同一浓度，严格按照TAKARA公司反转录试剂盒的说明书上操作步骤对各样品的总RNA反转录。采用SYBR Green Supermix(ROCHE)在LightCycler96荧光定量PCR仪(ROCHE)上检测各样品中各特异蛋白mRNA相对表达量，数据通过gapdh基因的Ct值来均一化。

表1 检测候选特异蛋白mRNA相对表达量的引物Table 1 Primers used to detect mRNA relative expression abundance of candidate protein

1.3 统计学分析

采用2-ΔΔCt公式计算各特异蛋白mRNA相对表达量，用平均值±标准差表示[23]。应用SPSS19.0(IBM Corp.,USA)软件对所测数据进行统计学分析。应用One-way ANOVA方法分析同一品种苜蓿三个生长周期间顶芽中各特异蛋白mRNA相对表达量的差异显著性,以及三个生长期间两品种顶芽中各特异蛋白mRNA相对表达量的差异显著性，并应用GraphPad prism 5(GraphPad Software,Inc.,USA)软件对各数据进行线型图的制作。

1.4 过表达和沉默载体构建、工程菌和转基因植株的建立

应用内切酶将特异蛋白基因的CDS区与过表达载体pCAMBIA3301构建各自的过表达重组载体，选取CDS区约500 bp序列与沉默载体系统(pHANNIBAL和pART27)构建各自的沉默重组载体，按照农杆菌转化方法将各自的过表达、沉默重组载体和空载体转入农杆菌LBA4404感受态细胞，分别获得各自过表达和沉默工程菌株。以RBP47C基因为例展示构建过表达和沉默载体结构简图(图1和图2)，红色片段是目的基因的位置。

图1 RBP47C过表达载体结构简图Fig.1 Structural diagram of RBP47C overexpression vector

图2 RBP47C沉默载体结构简图Fig.2 Structural diagram of RBP47C silencing vector

过表达工程菌株和空载体菌株侵染秋眠9级苜蓿‘WL903’(非秋眠型苜蓿品种)子叶节节点受伤幼苗，各自沉默工程菌株和空载体菌株侵染秋眠2级苜蓿‘伏纳尔’子叶节节点受伤幼苗，转入MS固体培养基中并在温度24℃，16 h光照条件下培养，待主根长至5 cm和至少出现5根须根时，即可将幼苗转至营养土中继续在温度24℃，16 h光照条件下培养。幼苗长成良好植株后，首先应用植物基因组DNA提取试剂盒提取最终成活的植株的基因组DNA，以各植株的基因组DNA为模板，应用载体上的Bar基因和nptII基因引物进行PCR鉴定，得到阳性的转基因苗，待转基因阳性苗、空载体对照苗完全成活并长成良好植株后刈割，刈割后10 d观察植株表型。同时，未侵染的两苜蓿品种野生型植株按照上述培养过程培养用于表型比较。

苜蓿子叶节节点受伤幼苗准备步骤：挑选优质饱满的苜蓿种子直接在滤纸上萌发，要求加入无菌水保持滤纸湿润。约4 d后，即真叶出现之前，在超净工作台中用灭菌手术刀从子叶节节点处切除1片子叶，获得子叶节节点受伤幼苗，将剩余的幼苗放于50 mL无菌水中，加入农杆菌工程菌液0.5 mL并在28℃，100 rpm振荡器中侵染1 h，侵染后用镊子将幼苗取出，并置于无菌干燥滤纸上吸干工程菌液后，将侵染后的幼苗转入MS固体培养基中，并在温度24℃，16 h光照条件下培养，待主根长至5 cm和至少出现5根须根时期，将幼苗转至营养土中继续在温度24℃，16 h光照条件下培养[24]。

2 结果与分析

2.1 ‘Maverick’和‘Cuf101’苜蓿顶芽中各自特异表达蛋白

经过特异表达蛋白分析发现,在秋季‘Maverick’苜蓿顶芽特异性表达的候选蛋白包括：酪氨酸/多巴脱羧酶(AES81613)、聚腺苷结合蛋白RBP47C (KEH40057)和乙二醛酶/博莱霉素抗性蛋白/双加氧酶(KEH32483)；‘Cuf101’苜蓿顶芽特异表达的候选蛋白包括：S-腺苷甲硫氨酸依赖甲基转移酶(AET04140)、假设蛋白AES61470。

从未秋眠至秋眠过程中，mRNA相对表达量检测结果表明：在秋季‘Maverick’苜蓿顶芽中聚腺苷结合蛋白RBP47CmRNA相对表达量较春夏季‘Maverick’苜蓿和春夏秋季‘Cuf101’苜蓿顶芽中的均显著升高(图3)，从夏末至秋季,‘Cuf101’苜蓿顶芽中假设蛋白AES61470 mRNA相对表达量显著高于‘Maverick’苜蓿顶芽中的相对表达量(图4)。

图3 7—9月份两苜蓿品种顶芽中RBP47C蛋白mRNA相对表达量Fig.3 mRNA relative expression abundance of RBP47C in‘Maverick’and‘Cuf101’varieties apical buds from July to September注：#代表‘Maverick’苜蓿顶芽中RBP47C蛋白mRNA相对表达量显著高于‘Cuf101’苜蓿顶芽中的相对表达量(P<0.05)；*代表9月份‘Maverick’苜蓿顶芽中RBP47C蛋白mRNA相对表达量显著高于7,8月份时的相对表达量(P<0.05),误差线表示标准偏差(SD)Note:# indicate that RBP47C mRNA relative expression abundance in apical buds of‘Maverick’alfalfa at September is significant more than that in apical buds of‘Cuf101’alfalfa at July,August,September at the 0.05 level,* indicate that RBP47C mRNA relative expression abundance in apical buds of‘Maverick’alfalfa at September is significant more than that at July,August at the 0.05 level. Error bars indicate standard deviation (SD)

图4 7—9月份两苜蓿品种顶芽中假设蛋白AES61470 mRNA相对表达量Fig.4 mRNA relative expression abundance of hypothetical protein AES61470 in‘Maverick’and‘Cuf101’varieties apical buds from July to September注：#代表‘Maverick’苜蓿顶芽中假设蛋白AES61470 mRNA相对表达量显著低于‘Cuf101’苜蓿顶芽中的相对表达量(P<0.05),##代表‘Maverick’苜蓿顶芽中假设蛋白AES61470 mRNA相对表达量极显著低于‘Cuf101’苜蓿顶芽中的相对表达量(P<0.01),误差线表示标准偏差(SD)Note:# indicate that the hypothetical protein AES61470 mRNA relative expression abundance in apical buds of‘Maverick’alfalfa is significant less than that in apical buds of‘Cuf101’alfalfa at August at the 0.05 level,## indicate that the hypothetical protein AES61470 mRNA relative expression abundance in apical buds of‘Maverick’alfalfa is very significant less than that in apical buds of‘Cuf101’alfalfa at July and September at the 0.01 level. Error bars indicate standard deviation (SD)

2.2 特异蛋白功能鉴定

由图5、图6所示，聚腺苷结合蛋白RBP47C过表达的非秋眠型苜蓿品种‘WL903’植株株高显著(P<0.05)低于空载体对照和野生型植株株高，茎较细，叶片较小(图5)；RBP47C沉默的秋眠型苜蓿品种‘伏纳尔’植株株高显著(P<0.05)高于空载体对照和野生型植株株高，茎较粗(图6)。

图5 RBP47C过表达‘WL903’阳性植株与阴性植株表型比较Fig.5 Comparison of phenotypes betweenRBP47C overexpression positive‘WL903’plants and negative plants

图6 沉默RBP47C‘伏纳尔’植株与阴性植株表型比较Fig.6 Comparison of phenotypes between RBP47C silenced‘Vernal’plants and negative plants

3 讨论

植物具有适应环境的能力，蛋白质是生命活动的最主要载体，更是功能的执行者，随着四季的变换、环境的变化，植物体内蛋白质种类、数量都会随着改变。秋眠性是指从夏末至秋季由于日照长度缩短和温度下降，紫花苜蓿植株表现为缓慢匍匐生长或停止生长的一种特性。依据不同苜蓿品种在从夏末至秋季生长适应性表现不同将其分为不同的秋眠型苜蓿，在秋眠时期不同秋眠型苜蓿体内存在特异表达的蛋白和表达量差异的蛋白，秋眠型苜蓿和非秋眠型顶芽中也存在差异表达和特异表达的蛋白。由于目前常规高通量测序技术是基于蛋白相对含量的差异来筛选差异蛋白，所以特异表达的蛋白就会被遗漏。本研究结果表明，秋眠型苜蓿‘Maverick’的RBP47C蛋白在秋眠时期顶芽中特异表达，假设蛋白AES61470在‘Cuf101’苜蓿顶芽中较‘Maverick’苜蓿特异表达，这些结果验证常规高通量定量分析差异蛋白确实存在遗漏，而且验证了在秋季秋眠型苜蓿和非秋眠型顶芽中确实存在特异表达的蛋白。

RBP47C蛋白属于核蛋白中的Polyadenylate-binding proteins (PABs) 家族蛋白。PABs可影响植物的表型和环境抗性，过表达聚腺苷酸结合蛋白的植物的环境胁迫抗性和种子生产力较强[25]。本研究通过转基因技术对其进行功能验证表明：秋眠型苜蓿‘伏纳尔’品种沉默RBP47C后的植株较对照植株生长速度显著加快、植株高度极显著增高，非秋眠型苜蓿‘WL903’过表达RBP47C后的植株较对照植株生长速度显著变慢、植株高度极显著变矮，所以推测RBP47C的高表达促进苜蓿的秋眠。Li等研究表明酵母Pab1p在烟草(NicotianatabacumL.)中过表达可较强抑制植株的生长[26]，该结果与本研究结果一致。

PABs是高度保守RNA结合蛋白，它们特异性的结合mRNA 3′端聚腺嘌呤尾巴，参与基因翻译的起始、poly(A) 缩短[27]，参与决定细胞核中mRNA 3′端poly(A) 的长度[28-29]。烟草RBP47含有三个RBD型RNA结合结构域和富含谷氨酰胺的N-末端，它的两个RBD型RNA结合结构域对于RBP47与RNA的相互作用是必需的[30]；拟南芥(Arabidopsisthaliana)的RBP47与poly(A)+RNA形成有关[31]，因此推测RBP47C调控苜蓿秋眠性是通过调控其靶基因成熟mRNA的含量发挥作用的。

另外，PABs都作用于mRNA 3′端聚腺嘌呤尾巴，但是这些PABs氨基酸序列、结构和功能有差异，它们各自作用的mRNA不可能相同，所以推测它们特异作用于某些mRNA，并且特异性是由各个PABs的氨基酸组成和mRNA 3′端最后数位核苷酸的组成不同导致的，但是目前RBP47C是否有特异性作用的mRNAs尚未见研究报道，值得进一步研究。

4 结论

不同秋眠型苜蓿在秋眠时期具有其特异表达的蛋白，RBP47C 蛋白在秋眠苜蓿顶芽中特异表达，假设蛋白AES61470在非秋眠苜蓿顶芽中特异表达；RBP47C 蛋白高表达促进了苜蓿的秋眠、低表达加快了苜蓿的生长。