大黄灵仙方对LPS 诱导的肝内胆管组织损伤大鼠炎症反应及Wnt5a-Ca2+-PKC信号转导通路的影响①

张 曼 戴建业 俞 渊 唐乾利 陈金梅（湖南中医药大学研究生院，长沙 410208）

原发性肝内胆管结石（primary intrahepatic bile duct stones，PIS）始发于肝内胆管系统，是我国常见病和难治病［1］。研究发现肝内胆管组织反复炎症损伤是导致PIS 胆道淤塞、结石形成、甚至胆管癌的主要原因之一，因此预防和缓解胆道系统炎症反应是治疗肝内胆管结石形成的主要思路之一［2-3］。Wnt5a-钙离子（Ca2+）-活化蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）信号转导通路可诱导炎症因子释放并引起细胞损伤［4］。目前国内外对于该通路的研究多集中于心脑损伤、关节炎、癌症等疾病，但其在肝内胆管结石形成过程中的调控作用尚未见报道［5］。此外，肝内胆管结石治疗一直是胆道外科难题，外科手术是西医主要治疗手段，但术后复发率较高，严重危害患者身心健康［6］。因此探寻PIS 新的治疗手段尤为重要。课题组经验方大黄灵仙方具有疏肝利胆、攻下排石功效，可有效防止肝内胆管结石形成，得到广大医生和患者认可，且前期研究发现其能抑制胆管细胞炎症损伤，但分子机制尚不明确［7］。本研究推测大黄灵仙方可能通过Wnt5a-Ca2+-PKC通路抑制胆管系统炎症损伤，进而防治肝内胆管结石，并建立PIS 动物模型对此进行验证，以期为临床合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6～8 周龄清洁级健康SD 大鼠70只，体质量200～250 g，由广西壮族自治区食品药品检验所实验动物中心提供，合格证号：SCXX（桂）2019-0001，动物质量合格证号：省科2000A027。所有大鼠于湖南中医药大学研究生院层流动物房常规饲养，本研究经湖南中医药大学研究生院动物伦理委员会批准，批号：IACUC-01（20160917），试验符合3R原则。

1.1.2 主要试剂及仪器 大黄灵仙方由生大黄15 g、威灵仙30 g、芒硝10 g、金钱草30 g、枳壳12 g、鸡内金10 g、泽兰15 g、柴胡12 g、郁金12 g、磁石12 g、黄芪30 g、甘草5 g 组成，各中药配方颗粒剂由江阴天江药业有限公司提供，购于广西中医药大学第一附属医院。HE染色试剂盒（货号：E677218-0200，上海生物公司）；血清总胆红素（TBIL）、总胆汁酸（TBA）ELISA试剂盒（货号：F6696-A、F6697-A，上海奥陆生物科技有限公司）；大鼠IL-6、肿瘤坏死因子（TNF-α）等ELISA试剂盒（货号：CSB-E04640r、CSB-E69066r，武汉华美生物工程有限公司）；Trizol试剂盒、反转录试剂盒（货号：15596026、4366597，赛默飞世尔中国公司）；Fluo-3/AM 钙荧光指示剂（货号：JB0234，江苏碧云天生物有限公司）；Wnt5a、骨桥蛋白（OPN）、PKC、IL-6 抗体（货号：ab229200、ab75285、ab32376、ab229381，美国Abcam 公司）；BCA 蛋白定量试剂盒和胰蛋白酶（货号：P0768、P0231，美国Pierce公司）；光学显微镜（SMZ745，日本尼康公司）；激光扫描共聚焦显微镜（LSM510，德国Carl Zeiss 公司）；冰冻切片机（CM3050S，德国Leica公司）；蛋白电泳仪、半干转膜仪（1659001、Trans-Blot SD，美国 Bio-Rad 公司）；化学发光仪（GIS-500，杭州米欧仪器公司）等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胆管炎症损伤模型建立及分组给药SD 大鼠随机分为正常对照组、模型组、大黄灵仙方（320 mg/kg）组、炎症信号阻断剂组（PDTC+SB203580，120 mg/kg+10 mg/kg）、大黄灵仙方+信号阻断剂组（320 mg/kg+120 mg/kg+10 mg/kg），每组12只，除正常对照组外，其余各组大鼠均参照文献［8］采用戊巴比妥钠麻醉，暴露胆总管，均经胆总管内缓慢注入1 ml LPS 溶液（2 μg/ml），分层关腹，建立PIS模型。正常对照组经胆总管内缓慢注入1 ml 生理盐水，其余均同模型组。建模前3 d 开始灌胃给药，正常对照组及模型组给予生理盐水，大黄灵仙方组及炎症信号阻断剂组按文献［7］设置剂量并进行灌胃及腹腔注射干预3 d。

1.2.2 大鼠标本采集 末次给药12 h，取各组麻醉后大鼠腹主动脉血2 ml，分离血清置于-20℃保存。各组随机取6 只大鼠，迅速处死，开腹，并经下腔静脉注射肝素进行全身肝素化灌注预热，待肝脏变为均一的土黄色时，在外科显微镜下取完整胆管树，称重，置于液氮中冷冻30 min，-80℃保存。另外6只大鼠同样取胆管树组织标本，部分置于-80℃保存，其余部分清洗后置于4%多聚甲醛溶液固定。

1.2.3 各组大鼠血清炎症因子及肝功能指标检测 取1.2.2 中血清，4℃冰箱解冻，按照ELISA 试剂盒说明书检测血清炎症因子TNF-α、IL-6 及肝功能指标TBIL、TBA水平。

1.2.4 各组大鼠胆管组织HE染色病理形态观察取1.2.2 中4%多聚甲醛中胆管组织，常规透明，浸蜡，包埋，切片（5 μm），按HE 试剂盒说明书染色，光镜下观察组织形态。

1.2.5 RT-qPCR 检测胆管组织 Wnt5a、OPN 及 PKC mRNA 表达 取各组1.2.2 中-80℃ 保存的胆管组织，4℃ 解冻，匀浆，Trizol 试剂盒抽提总RNA，采用反转录试剂盒将1 μg RNA 反转录为cDNA，并以此为模板进行RT-qPCR 反应。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物设计见表1。以β-actin 为 内 参 ，2-ΔΔCt法 计 算 Wnt5a、OPN 及 PKC mRNA相对表达。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 RT-qPCR primer sequences

1.2.6 Western blot 法检测胆管组织中Wnt5a、OPN、PKC、IL-6 蛋白表达 取 1.2.2 中-80℃ 保存胆管组织，4℃解冻，蛋白提取试剂盒提取蛋白，BCA 试剂盒检测蛋白总浓度。取50 μg 蛋白上样，进行电泳和转膜反应，TBST溶液清洗，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST 溶液清洗3 次，加入一抗（Wnt5a、OPN、PKC、IL-6、β-actin），内参抗体1∶2 000稀释，其余抗体1∶1 000 稀释，4℃摇床室温孵育过夜，TBST 振洗，加入 HRP 羊抗兔二抗（1∶2 000 稀释），37℃ 摇床室温孵育1 h，TBST 清洗3 次，增强化学发光法显色，化学发光仪观察条带并拍照，Image J软件分析各组蛋白相对表达。

1.2.7 荧光免疫法检测胆管组织细胞Ca2+浓度取1.2.2中胆管树组织标本，冷冻切片机切片（8 μm），按Fluo-3/AM 钙荧光指示剂说明书进行荧光标记，调整激光共聚焦显微镜激发波长为488～500 nm，物镜下观察胆管组织Ca2+荧光强度，荧光强弱反映细胞内游离钙水平，Image-RroPlus6.0 图像处理系统测定标本浅层区域面积及荧光强度，以单位面积荧光强度表示胆管组织细胞Ca2+水平［9］。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两组间比较采用SNK-q检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大黄灵仙方对血清TBIL、TBA 水平的影响与正常对照组相比，模型组大鼠血清TBIL、TBA 水平升高（P＜0.05）。与模型组相比，炎症信号阻断剂组及大黄灵仙方组大鼠血清TBIL、TBA 水平均降低（P＜0.05）；与炎症信号阻断剂组及大黄灵仙方组相比，大黄灵仙方+信号阻断剂组大鼠血清TBIL、TBA水平进一步降低（P＜0.05，表2）。

表2 大鼠血清TBIL、TBA水平比较（，n=12，μmol/L）Tab.2 Comparison of serum TBIL and TBA levels of rats（，n=12，μmol/L）

表2 大鼠血清TBIL、TBA水平比较（，n=12，μmol/L）Tab.2 Comparison of serum TBIL and TBA levels of rats（，n=12，μmol/L）

Note：Compared with normal control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with inflammatory signal blocker，3）P＜0.05；compared with Dahuang Lingxian prescription，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Inflammatory signal blocker Dahuang Lingxian prescription Dahuang Lingxian prescription+signal blocking agent TBIL 2.36±1.39 142.98±19.211）89.14±13.621）2）53.27±9.861）2）3）TBA 8.60±3.56 129.28±17.361）82.54±11.071）2）59.62±10.351）2）3）35.82±6.121）2）3）4）37.29±7.131）2）3）4）

2.2 大黄灵仙方对血清炎症因子的影响 与正常对照组相比，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6 水平均升高（P＜0.05）。与模型组相比，炎症信号阻断剂组及大黄灵仙方组大鼠血清TNF-α、IL-6水平均降低（P＜0.05）。与炎症信号阻断剂组及大黄灵仙方组相比，大黄灵仙方+信号阻断剂组大鼠血清TNF-α、IL-6水平进一步降低（P＜0.05，表3）。

表3 大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较（，n=12）Tab.3 Comparison of serum TNF-α and IL-6 levels of rats（，n=12）

表3 大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较（，n=12）Tab.3 Comparison of serum TNF-α and IL-6 levels of rats（，n=12）

Note：Compared with normal control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with inflammatory signal blocker，3）P＜0.05；compared with Dahuang Lingxian prescription，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Inflammatory signal blocker Dahuang Lingxian prescription Dahuang Lingxian prescription+signal blocking agent TNF-α/（ng·L-1）11.16±1.69 39.15±3.401）33.09±3.311）2）25.04±2.521）2）3）IL-6/（pg·ml-1）103.09±10.09 185.32±18.101）166.08±16.121）2）144.84±14.151）2）3）19.12±1.641）2）3）4）124.38±14.141）2）3）4）

2.3 大黄灵仙方对胆管组织形态的影响 正常对照组大胆管组织形态正常。模型组大鼠可见胆管细胞变性、增生，汇管区淋巴细胞、浆细胞浸润及胆小管扩张淤积明显。炎症信号阻断剂组、大黄灵仙方组、大黄灵仙方+信号阻断剂组大鼠胆管组织变性、炎症浸润等病理损伤现象逐渐缓解（图1）。

图1 各组大鼠胆管组织HE染色（×200）Fig.1 HE staining of bile duct tissue of rats in each group（×200）

2.4 大黄灵仙方对胆管组织Wnt5a、OPN 及PKC mRNA 表达的影响 与正常对照组相比，模型组大鼠胆管组织Wnt5a、OPN 及PKC mRNA 表达水平升高（P＜0.05）。与模型组相比，炎症信号阻断剂组及大黄灵仙方组大鼠胆管组织Wnt5a、OPN 及PKC mRNA 表达水平降低（P＜0.05）。与炎症信号阻断剂组及大黄灵仙方组相比，大黄灵仙方+信号阻断剂组大鼠胆管组织Wnt5a、OPN 及PKC mRNA 表达进一步降低（P＜0.05，表4）。

表4 大鼠胆管组织Wnt5a、OPN 及PKC mRNA 表达比较（，n=6）Tab.4 Comparison of mRNA expressions of Wnt5a，OPN and PKC in bile duct tissue of rats（，n=6）

表4 大鼠胆管组织Wnt5a、OPN 及PKC mRNA 表达比较（，n=6）Tab.4 Comparison of mRNA expressions of Wnt5a，OPN and PKC in bile duct tissue of rats（，n=6）

Note：Compared with normal control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with inflammatory signal blocker，3）P＜0.05；compared with Dahuang Lingxian prescription，4）P＜0.05.

Groups Normal control Model Inflammatory signal blocker Dahuang Lingxian prescription Dahuang Lingxian prescription+signal blocking agent Wnt5a/β-actin 0.16±0.09 1.33±0.151）OPN/β-actin 0.19±0.06 1.36±0.161）PKC/β-actin 0.18±0.08 1.39±0.141）1.01±0.121）2）1.03±0.131）2）1.07±0.121）2）0.74±0.131）2）3）0.71±0.121）2）3）0.73±0.141）2）3）0.42±0.121）2）3）4）0.48±0.131）2）3）4）0.42±0.131）2）3）4）

2.5 大黄灵仙方对胆管组织Wnt5a、OPN、PKC 及IL-6 蛋白表达的影响 与正常对照组相比，模型组大鼠胆管组织 Wnt5a、OPN、PKC 及 IL-6 表达水平均升高（P＜0.05）。与模型组相比，炎症信号阻断剂组及大黄灵仙方组大鼠胆管组织Wnt5a、OPN、PKC 及IL-6 表达水平均降低（P＜0.05）。与炎症信号阻断剂组及大黄灵仙方组相比，大黄灵仙方+信号阻断剂组大鼠胆管组织Wnt5a、OPN、PKC及IL-6表达水平进一步降低（P＜0.05，图2、表5）。

表5 大鼠胆管组织Wnt5a、OPN、PKC及IL-6表达比较（，n=6）Tab.5 Comparison of expressions of Wnt5a，OPN，PKC and IL-6 in bile duct tissue of rats（，n=6）

表5 大鼠胆管组织Wnt5a、OPN、PKC及IL-6表达比较（，n=6）Tab.5 Comparison of expressions of Wnt5a，OPN，PKC and IL-6 in bile duct tissue of rats（，n=6）

Note：Compared with normal control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with inflammatory signal blocker，3）P＜0.05；compared with Dahuang Lingxian prescription，4）P＜0.05.

IL-6/β-actin 0.38±0.10 1.59±0.131）1.22±0.141）2）0.89±0.111）2）3）0.42±0.101）2）3）4）Groups Normal control Model Inflammatory signal blocker Dahuang Lingxian prescription Dahuang Lingxian prescription+signal blocking agent Wnt5a/β-actin 0.26±0.09 1.43±0.151）1.11±0.121）2）0.84±0.131）2）3）0.49±0.121）2）3）4）OPN/β-actin 0.29±0.06 1.46±0.161）1.13±0.131）2）0.81±0.121）2）3）0.51±0.131）2）3）4）PKC/β-actin 0.28±0.08 1.49±0.141）1.17±0.121）2）0.83±0.141）2）3）0.52±0.131）2）3）4）

图2 Western blot 检测各组大鼠胆管组织Wnt5a、OPN、PKC及IL-6蛋白表达Fig.2 Western blot of Wnt5a，OPN，PKC and IL-6 protein expressions in bile duct tissue of rats in each group

2.6 大黄灵仙方对胆管组织细胞内Ca2+水平的影响 与正常对照组相比，模型组大鼠胆管组织细胞荧光强度较高，细胞内游离Ca2+水平升高（P＜0.05）。与模型组相比，炎症信号阻断剂组及大黄灵仙方组大鼠胆管组织细胞荧光强度较低，细胞内游离Ca2+水平均降低（P＜0.05）。与炎症信号阻断剂组及大黄灵仙方组相比，细胞内游离Ca2+水平进一步降低（P＜0.05，图3、表6）。

表6 大鼠胆管组织细胞内Ca2+水平比较（，n=6）Tab.6 Comparison of intracellular Ca2+ levels in bile duct tissues of rats（，n=6）

表6 大鼠胆管组织细胞内Ca2+水平比较（，n=6）Tab.6 Comparison of intracellular Ca2+ levels in bile duct tissues of rats（，n=6）

Note：Compared with normal control，1）P＜0.05；compared with model，2）P＜0.05；compared with inflammatory signal blocker，3）P＜0.05；compared with Dahuang Lingxian prescription，4）P＜0.05.

Ca2+level/AU 0.50±0.05 1.86±0.131）0.76±0.071）2）0.67±0.051）2）3）0.58±0.041）2）3）4）Groups Normal control Model Inflammatory signal blocker Dahuang Lingxian prescription Dahuang Lingxian prescription+signal blocking agent

图3 各组大鼠胆管组织细胞Ca2+水平荧光图（×400）Fig.3 Fluorescence diagram of Ca2+level in bile duct tissue cells of rats in each group（×400）

3 讨论

现代医学认为胆石症与胆管炎症关系密切，胆管炎症反应会引起胆管炎性狭窄、梗阻及胆汁引流不畅，是胆石症形成的关键病理机制［10］。LPS 可诱导或加重机体炎症反应，引起结石或导致结石复发率上升［11］。本研究经胆管内注射LPS 后发现，大鼠血清TNF-α、IL-6 及胆管组织IL-6 蛋白表达均显著高于正常对照组，同时肝组织出现胆管细胞变性、增生、汇管区炎症浸润、胆管扩张淤积等病理损伤，与人类胆管结石组织病理学相似，提示造模成功［12］。另外，文献证实PIS 患者结石化学成分中绝大部分为胆红素钙结石，且临床发现胆石症患者血清肝功能指标 TBIL、TBA 水平均不同程度升高［13］。本研究也检测到模型组大鼠血清TBIL、TBA 水平异常升高，进一步表明造模成功。

中医将胆石症归为“胁痛”“黄疸”范畴，认为“外感六淫、情志不畅、饮食失节、脾胃虚弱、肝阴不足”等所致肝胆气机不畅，疏泄失常，湿热蕴蒸于肝胆，胆汁通降不畅，日久成石，堵塞于胆道是胆石症形成的主要病机，主要以疏利肝胆、清热利湿药疏通脏腑淤积，且疗效较好［14］。本科室经验方大黄灵仙方中金钱草、柴胡、鸡内金、郁金及泽兰等药物均可入肝胆，具有清热、利湿、解郁之功，白芍、黄芪等养阴柔肝、补气升阳能调畅肝胆气机而解淤滞，全方契合胆石症的病因病机，重在清热利湿、疏肝利胆排石。另外，研究报道金钱草、鸡内金、郁金在泌尿系统结石中有较好的排石功效［15］。本研究发现大黄灵仙方组大鼠血清TNF-α、IL-6及胆管组织IL-6蛋白表达降低，且肝胆管组织病理损伤明显减轻，表明大黄灵仙方能够降低炎症反应、缓解肝内胆管组织炎症损伤。

药物治疗胆石症常从削弱炎症信号通路出发，通过减轻炎症反应减少结石形成［16］。Wnt5a/Ca2+信号转导通路可调控炎症反应降低组织损伤［17］。研究证实炎症刺激下，细胞中的Wnt5a可与卷曲蛋白-2受体特异性结合，激活G蛋白和散乱蛋白，引起细胞内Ca2+浓度升高，在活化PKC 及钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ表达的同时，诱发IL-6、TNF-α 等炎症因子大量表达，加重组织损伤［18-19］。本研究发现，模型组大鼠胆管组织中Wnt5a、PKC mRNA 及蛋白表达、细胞内Ca2+水平异常高于正常对照组，提示Wnt5a-Ca2+-PKC 信号通路活化可能参与胆管组织炎症反应。另外，促炎细胞因子也可诱导巨噬细胞分泌OPN，通过与细胞表面OPN 受体结合放大炎症反应，加速细胞凋亡［20］。Wnt5a 与 OPN 间也存在调控关系，在膝关节炎中被证明共同参与炎症反应进程［21］。本研究在模型组大鼠胆管组织中检测到OPN mRNA 及蛋白表达异常增高，而采用炎症信号阻断剂阻断炎症反应后，随着大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-6 及胆管组织 IL-6 蛋白表达降低，大鼠胆管组织中Wnt5a、PKC mRNA、OPN mRNA 及蛋白表达、细胞内Ca2+水平降低的同时，肝胆管组织病理损伤明显缓解，进一步证实Wnt5a-Ca2+-PKC 信号通路参与胆管组织炎症反应。给予大黄灵仙方治疗后，大鼠胆管组织中Wnt5a、PKC、OPN mRNA 及蛋白表达、细胞内Ca2+水平均降低，提示大黄灵仙方可抑制Wnt5a-Ca2+-PKC 信号通路活化，可能是其降低胆管组织炎症反应、防治胆管结石的机制之一。而大黄灵仙方与炎症通路阻断剂联用后，大鼠上述通路指标进一步降低的同时，胆管组织炎症损伤也进一步缓解，表明炎症信号阻断剂可进一步促进大黄灵仙方抑制Wnt5a-Ca2+-PKC信号通路活化作用。

综上所述，大黄灵仙方可能通过抑制Wnt5a-Ca2+-PKC 信号通路活化降低胆管组织炎症反应，为阐明大黄灵仙方防治胆管结石的分子机制提供参考。但中药防治胆管结石的靶点及途径较多，有待进一步研究。