生长抑素抗独特型卵黄抗体对大鼠胰岛SST受体定位及功能调节的研究

廉静轩 李 丹 黄晓文 付建芳 （空军军医大学西京医院内分泌科，西安 710032）

生长抑素（somatostatin，SST）是一种广泛存在于各组织中的肽激素，在胰腺内外分泌腺中大量存在，主要有SST-14 和SST-28 两种形式，通过结合生长抑素受体（somatostatin receptor，SSTR）发挥生理作用［1］。SSTR 在人大脑、垂体前叶、胰岛、肾上腺皮质和髓质、甲状腺、卵巢、睾丸等组织均有表达［2］。SST 的生理作用是抑制生长激素（growth hormone，GH）分泌，还可抑制人类和多种物种胰岛分泌胰岛素和胰高血糖素，而胰岛素和胰高血糖素是调节血糖水平的重要激素［3］。文献显示，敲除SSTR5 受体的小鼠胰岛素含量显著提高，相比于SST 基因缺失小鼠，其胰岛数量、大小、结构、胰岛素及胰高血糖素含量均正常，提示胰腺中SST 可能通过SSTR5 调节胰岛素水平［4］。还有学者通过敲除SSTR2 发现，SSTR2 缺失，SST 影响胰高血糖素释放，但不影响胰岛素释放［5］。敲除SSTR5可降低SST-28抑制葡萄糖诱导的胰岛素分泌效力［6］。因此在大鼠中，SRIF 通过不同SSTR抑制胰腺分泌胰岛素和胰高血糖素。

1974 年，JERNE 首次提出“免疫系统网络理论”，其核心是抗体的独特型（idiotype，Id），诱导机体产生抗独特型（anti-idiotypic）抗体，抗独特型抗体可特异性结合抗体的抗原结合区域，与抗原形成“内像”关系，模拟抗原的三维结构，充当抗原分子替代物。文献报道，单克隆和多克隆抗独特型抗体技术已广泛用于疫苗开发、疾病治疗和小分子检测等领域［7］。

IgY 是鸡体内主要的循环抗体，对产蛋鸡进行外源致病菌免疫可产生特异性IgY。由于受体作用，IgY 主要贮存于卵黄，使卵黄中IgY 抗体浓度升高。IgY 与哺乳动物IgG 具有相似生物学作用。但与传统的哺乳动物抗体相比，IgY 具有成本效益高、无创、性质稳定、效率高、安全性好等优点。此外，据报道，IgY对肠道蛋白酶有较强的耐消化能力［8］。

下丘脑垂体轴是人与动物重要的神经内分泌调节轴，对人与动物的生长起关键调节作用，生长抑素是该调节轴的重要调节激素。生长抑素抗独特型抗体可模拟生长抑素功能，但能否穿过血脑屏障参与下丘脑垂体轴调节尚未阐明。小鼠模型中，高亲和力的人抗体可穿过血脑屏障［9］。高亲和力的抗独特型单克隆抗体也可穿过血脑屏障发挥作用［10］。课题组既往研究发现，小鼠腹腔注射猪SST单克隆抗体，可显著提高循环血中GH 水平［11］。采用猪抗SST抗独特型卵黄抗体作为疫苗免疫接种小鼠、鸡和多宝鱼，1 个月后平均增重率显著高于对照组，但接种剂量过大其增重率则低于对照组［12］。说明SST 被动免疫外加的SST 单克隆抗体和主动免疫产生的SST 抗体可穿过血脑屏障，中和下丘脑产生的生长激素释放抑制激素，降低其对脑垂体GH 细胞的抑制作用，使GH 分泌增加，进而促进动物生长，剂量过大时，SST 抗独特型卵黄抗体可加强SST对垂体GH 细胞的抑制作用，使GH 分泌减少，进而抑制动物生长。课题组合作单位西安咸辅生物科技有限责任公司已成功制备人SST抗独特型卵黄抗体，并证明其可模拟SST功能显著抑制肝癌、胃癌及乳腺癌细胞［13］。但人SST抗独特型卵黄抗体对胰腺特别是胰腺内分泌细胞的功能是否产生影响尚未见报道。本研究拟用该抗独特型卵黄抗体对大鼠胰腺SST 受体进行共定位，研究其对胰岛细胞功能和糖尿病模型大鼠血糖是否产生调节作用，为探讨其能否用于糖尿病治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品、试剂和仪器 人生长抑素抗独特型卵黄抗体和兔抗SST抗体由西安咸辅生物科技有限责任公司提供；兔抗胰岛素抗体、兔抗胰高血糖素抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗及荧光标记的二抗均购于英国Abcam 公司；胰岛素、胰高血糖素试剂盒购于南京赛泓瑞生物科技有限公司。

1.1.2 实验动物 8 周龄雄性SD 大鼠由空军军医大学试验动物中心提供，体质量约250 g，饲养于SPF级动物房，普通饲料喂养。

1.2 方法

1.2.1 动物建模 健康SD 大鼠高糖高脂饮食4 周后禁食 12 h，腹腔注射STZ（30 mg/kg），72 h 后尾静脉测量血糖≥16.7 mmol/L为建模成功［14］。

1.2.2 DAB 染色 雄性SD 大鼠灌注固定，取胰腺用 4%多聚甲醛固定 4～6 h，冰冻切片，PBS 洗 3 次×10 min，加入人生长抑素抗独特型卵黄抗体（1∶500）4℃ 过夜，PBS 洗 3 次×10 min，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡 IgY 抗体（1∶1 000）室温孵育 2 h。PBS 洗 3 次×10 min，加反应底物 DAB 显色 3～5 min（显微镜下控制显色时间）。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察并拍照记录。

1.2.3 免疫荧光共定位染色 雄性SD大鼠灌注固定，取胰腺用4%多聚甲醛固定4～6 h，冰冻切片，PBS洗3次×10 min，加入SST抗独特型卵黄抗体（1∶100）、兔抗胰岛素抗体（1∶200）、兔抗胰高血糖素抗体（1∶200）、兔抗生长抑素抗体（1∶200）常温孵育18～20 h，PBS 洗 3 次×10 min。加入 FRITC 标记的山羊抗鸡 IgY 抗体，常温静置 4 h，PBS 洗 3 次×10 min，加入FITC 标记山羊抗兔IgG 抗体，常温静置2 h，PBS 洗 3 次×10 min，采用含 DAP 荧光封片剂封片，荧光共聚焦显微镜观察并拍照记录。

1.2.4 ELISA 检测胰岛素和胰高血糖素水平 取正常SD 大鼠15 只，随机分为对照组、实验组Ⅰ、实验组Ⅱ，每组5 只。对照组腹腔注射1 ml 生理盐水后1%戊巴比妥麻醉，心脏抽血离心，取血浆（0 点）4℃保存；实验组Ⅰ腹腔注射1 ml SST抗独特型卵黄抗体（含IgY 4 mg）30 min 后1%戊巴比妥麻醉，心脏抽血离心，取血浆4℃保存；实验组Ⅱ腹腔注射1 ml SST抗独特型卵黄抗体60 min后1%戊巴比妥麻醉，心脏抽血离心，取血浆4℃保存。ELISA 检测胰岛素和胰高血糖素水平：采用包被缓冲液将各组血浆进行1∶100稀释，加至反应孔（100 μl/孔），每只动物每种激素设2 个复孔，常温静置1 h，弃孔内液体，PBS 洗3 次，3 min/次，分别加入兔抗胰岛素和兔抗胰高血糖素抗体（1∶1 000）常温静置30 min，弃孔内液体，同上洗涤，加入酶标羊抗兔IgG（1∶1 000）常温静置30 min，弃孔内液体，同上洗涤，加反应底物OPD常温避光显色10～15 min，加终止液，测量492 nm 处吸光度（A），A待测孔≥2.1A阴性对照孔即为阳性反应。血糖仪同步检测大鼠尾静脉血糖水平。

1.2.5 糖耐量实验 取糖尿病大鼠10 只，随机分为SST抗独特型卵黄抗体治疗组与不治疗组，另取5只正常SD 大鼠为NC 组，SST 抗独特型卵黄抗体治疗组每日腹腔注射SST抗独特型卵黄抗体。血糖仪检测大鼠每日空腹血糖水平。最后1 d 进行各组大鼠糖耐量实验。检测前一晚所有大鼠禁食8 h，第2天清晨检测空腹血糖（FBG），腹腔注射50%葡萄糖溶液［2 g/（kg·d）］，尾静脉取血，测量各组大鼠餐后不同时间点血糖水平。

1.3 统计学处理 所有免疫组织学评估均采用适当的随机化和盲法，采用GraphPad Prism7 软件制图。采用SPSS19.0软件进行统计学分析，结果以表示。组间数据多重比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两组比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠胰腺SST受体分布 DAB染色结果显示，SST 受体免疫反应阳性物质广泛分布于大鼠胰岛细胞，且胰岛毛血管内皮细胞和淋巴细胞也呈SST 受体阳性，阳性物质呈红棕色，分布于细胞质和细胞膜，胞核着色较浅（图1）。

图1 正常大鼠胰岛细胞DAB染色（×40）Fig.1 DAB staining of normal rat islet cells（×40）

2.2 免疫荧光共定位观察结果 胰高血糖素、胰岛素、生长抑素免疫反应阳性物质呈绿色荧光（图2A、D、G）。SST 抗独特型卵黄抗体显示的SST受体免疫反应阳性物质呈红色荧光（图2B、E、H），且胰高血糖素与SST受体免疫反应阳性物质共定位于A 细胞，胰岛素与SST 受体免疫反应阳性物质共定位于B 细胞，生长抑素与SST 受体免疫反应阳性物质共定位于D 细胞，共定位细胞呈橙黄色荧光（图2C、F、I）。

图2 免疫荧光检测大鼠胰岛SST受体与胰岛素、胰高血糖素、生长抑素共定位（×40）Fig.2 Co-location of SST receptor and insulin，glucagon and somatostatin in rat islet by immunofluorescence（×40）

2.3 SST 抗独特型卵黄抗体对正常大鼠胰岛内分泌激素和血糖的影响 注射SST抗独特型卵黄抗体后不同时间点，大鼠胰高血糖素和胰岛素水平逐渐下降，胰高血糖素在注射60 min 后差异具有统计学意义，胰岛素在注射30 min后有统计学差异（图3A，P＜0.01）。注射SST 抗独特型卵黄抗体后大鼠血糖水平逐渐降低，注射60 min 后差异具有统计学意义（图3B，P＜0.05）。

图3 不同时间点大鼠胰岛素、胰高血糖素及血糖水平Fig.3 Insulin，glucagon and glucose levels in rats at different time points

2.4 SST 抗独特型卵黄抗体对STZ 诱导的糖尿病大鼠血糖的影响 腹腔注射SST抗独特型卵黄抗体后，糖尿病大鼠血糖随时间逐渐下降，第5～10 天差异有统计学意义（图4A，P＜0.05，P＜0.01）。糖耐量实验显示，SST 抗独特型卵黄抗体治疗组大鼠各点血糖值均高于正常对照组，但均低于未治疗组（图4B，P＜0.001），说明治疗组相比于不治疗组糖耐量明显改善。

图4 大鼠糖耐量实验和不同时间点血糖水平Fig.4 Rat glucose tolerance test and glucose levels at different time points

3 讨论

生长抑素对胰腺特别是胰岛功能发挥重要调节作用，其调节作用是通过与SST 受体结合而实现［15］。SST 受体在胰岛细胞广泛分布，研究者通过反转录PCR 证明SSTR 所有亚型均分布于大鼠整个胰腺［16］。本研究采用SST抗独特型卵黄抗体对大鼠胰腺进行免疫细胞化学染色，发现大鼠胰岛细胞及胰岛毛细血管内皮细胞和淋巴细胞均呈免疫阳性反应，说明课题组制备的SST 抗独特型卵黄抗体可与大鼠胰岛内分泌细胞及胰岛内毛细血管内皮细胞、淋巴细胞上SST 受体结合，呈SST 免疫反应阳性。

胰腺不同细胞分布不同SSTR 亚型，研究发现SSTR2A 分布于胰岛A 细胞和胰腺外分泌部腺上皮细胞，SSTR5 分布于大鼠胰岛 B 细胞［17］。通过共聚焦显微镜对人胰岛SSTR1～SSTR5 进行定量和定位分析发现，人胰岛内荧光强度顺序为SSTR1＞SSTR5＞SSTR2＞SSTR4＞SSTR3，SSTR1、SSTR5、SSTR2在B细胞表达较多，SSTR3 和SSTR4 在B 细胞表达较少；SSTR2 在 A 细胞表达较多，而 SSTR5 和 SSTR1 则在A 细胞表达较少；SSTR5 在D 细胞表达较多，而SSTR1、SSTR2 和 SSTR3 则在 D 细胞表达较少［7］。本研究通过对大鼠胰腺进行免疫荧光共定位，发现红色荧光的SST 受体和绿色荧光的胰岛素、胰高血糖素和生长抑素分别共定位于B 细胞、A 细胞和D 细胞，使其呈橙黄色荧光，说明课题组制备的SST抗独特型卵黄抗体可与SSTR不同亚型结合。

生长抑素对胰岛素和胰高血糖素分泌的影响报道较多，采用生长抑素对大鼠进行静脉灌注可显著降低循环血中胰岛素和胰高血糖素水平［18］。采用生长抑素对糖尿病患者进行静脉滴注可显著抑制糖尿病患者基础胰岛素和胰高血糖素水平，最高可达 50%［19］。

本研究通过对大鼠腹腔注射SST抗独特型卵黄抗体发现，给药后30 min 和60 min 循环血中胰岛素和胰高血糖素水平均显著降低（P＜0.05），同时血糖水平也显著降低（P＜0.05）。说明课题组制备的SST抗独特型卵黄抗体不仅可与SST 受体不同亚型结合，还可模拟SST 功能，调节胰岛功能和血糖水平。本研究采用间接ELISA法检测循环血中胰高血糖素和胰岛素含量，ELISA 主要用于肽类和蛋白定量检测 ，由 ENGVALL 和 PERLMENN 于 1971 年 首先 提出，目前已广泛用于免疫学、微生物学和寄生虫学检测，由于其灵敏度高、试剂稳定和设备简单等优点，近年被应用于食物中部分活性物质检测［20］。

奥曲肽是生长抑素类似物，可调节胰岛内分泌激素和血糖水平，已被证明对糖尿病有较好疗效［21］。本研究通过腹腔注射SST抗独特型卵黄抗体治疗STZ 诱导的糖尿病模型大鼠，发现其能显著降低糖尿病大鼠血糖水平。SST 抗独特型卵黄抗体分子量大，稳定性高，在体内不易被分解失效，克服了奥曲肽分子量小，在体内易被分解失效、半衰期短等缺点。同时卵黄抗体耐高温，方便保存和运输，作用途径多样，注射、口服均有效［22］。