基于LAMP的果蔬斯高维尔炭疽菌可视化检测方法

罗 跃，吴小毛，*，刘阿丽，姚小龙，李荣玉，耿广东

(贵州大学a.作物保护研究所；b.农学院，贵州 贵阳 550025)

斯高维尔炭疽菌()属尖孢炭疽菌复合种(Complex)，被译为好维尔炭疽、斯高威尔炭疽、斯科维尔炭疽等。近几年，斯高维尔炭疽菌在我国多地被发现报道，可引起辣椒、杧果、香蕉等果蔬炭疽病与苹果炭疽叶枯病。斯高维尔炭疽菌对辣椒的毒力较强，是中国辣椒炭疽病中上的优势致病菌。有关报道中斯高维尔炭疽菌几乎都分离自辣椒植株，其致病性、致病机理、抗性、感染预测等研究也多以辣椒为试验对象。贵州辣椒种植规模居全国之首，炭疽病普遍发生，经分离鉴定多个辣椒炭疽病病样发现，斯高维尔炭疽菌为贵州省内引起辣椒炭疽病的重要致病菌种。

病原菌的检测是炭疽病早期诊断和综合防治的基础，石妞妞等、刘西莉等报道了辣椒黑点炭疽菌()、平头炭疽菌()的PCR检测方法。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型核酸检测技术，已成功用于水稻、葡萄、苹果等多种植物的病原物检测，目前国内外尚未见将LAMP技术用于检测斯高维尔炭疽菌的报道。本研究以斯高维尔炭疽菌内部转录间隔区ITS序列为靶基因，设计4条LAMP引物和1条环引物，通过对引物比例、反应时间、反应体系等条件的选择，建立对斯高维尔炭疽菌具有特异性扩增的LAMP检测方法，以期为斯高维尔炭疽菌引起的果蔬炭疽病诊断和防治提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试试剂

DL2 000 marker，大连宝生物工程公司；dNTPs，TakaRa公司；10×Thermopol Buffer、甜菜碱、钙黄绿素、羟基萘酚蓝，Sigma；MgSO，天津市永大化学试剂有限公司；Bst DNA聚合酶，威展生物科技有限公司；DNA 胶回收试剂盒，博满生物科技有限公司；石蜡油，苏州禾森特种油品有限责任公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.2 主要仪器

立式压力蒸汽灭菌器、微波炉、DHG-9023A型恒温鼓风干燥箱、超净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SGZ150B型智能光照培养箱，常州澳华仪器有限公司；AL40电子天平，瑞士梅特勒公司；冰箱，新飞冰箱电器有限公司；等温PCR，北京蓝谱生物科技有限公司；HH-S8型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；电泳仪，美国 Bio-Rad 公司。

1.1.3 供试分离物

3株斯高维尔炭疽菌分别分离自贵阳、遵义和毕节的患炭疽病辣椒植株，以1株葡萄炭疽病胶孢炭疽菌()、3株百香果炭疽病喀斯特炭疽菌()、2株水稻稻瘟病菌和2株刺梨叶斑病菌为对照，对照菌株均来自贵州大学作物保护研究所。

1.2 LAMP检测方法

1.2.1 引物设计

利用靶基因的6个特定区域B1、B2、B3、F3c、F2c、F1c设计4条LAMP引物，被扩增的靶基因长度小于200 bp，内引物末端不含AT碱基对，引物的Tm值在55～65 ℃。根据LAMP设计的关键因素，如Tm值、GC含量等进行初筛，并对靶序列进行同源比对。核糖体内部转录间隔区(ITS)序列通过凝胶回收试剂盒纯化并回收扩增得到产物，根据斯高维尔炭疽菌核糖体的内部转录间隔区(ITS)序列使用Prime ExplorerV5软件在线设计的目标片段，设计了4条LAMP引物(FIP:上游内部引物，由F2和F1c组成；BIP：下游内部引物，由B1C和B2组成；F3：上游外部引物；B3：下游外部引物)和1条环引物LB，如表1所示。

表1 引物序列

1.2.2 LAMP反应体系和条件

首先进行引物优化。反应温度分别为60、62、64、65、66 ℃，反应时间分别为30、40、50、60、70 min进行优化，并对体系中dNTP，Bst DNA 聚合酶、甜菜碱、MgSO模板浓度采用正交试验法优化，得到LAMP 25 μL反应体系组合。试验选用钙黄绿素和羟基萘酚蓝作为指示剂。通过对比电泳结果进行分析，确定最佳引物组合。在80 ℃恒温水浴20 min即可失活。待反应结束后，观察颜色变化，用2%琼脂糖凝胶电泳检测反应结果。同时对LAMP产物进行扩增，选择条带较明亮、清晰的组合。

1.2.3 检测方法的特异性试验

检测靶标以斯高维尔炭疽菌DNA为阳性对照，无菌水和其他菌株为阴性对照。采用已建立的反应体系进行检测，反应结束后观察显色反应。加入钙黄绿素观察到绿色的样品判断为阳性，橘黄色判断为阴性；加入羟基萘酚蓝观察到颜色为蓝色的样品判断为阳性，紫色判断为阴性。取2 μL扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，若LAMP扩增呈梯形条带则为阳性，无扩增条带则为阴性。

2 结果与分析

2.1 LAMP 反应体系

用于检测斯高维尔炭疽菌的LAMP最佳反应体系为25 μL，组成如下：

10×热聚合酶2.5 μL；dNTP(10 mmol·L)3.5 μL；甜菜碱(5 mol·L)4 μL；Bst DNA聚合酶1 μL；MgSO(100 mmol·L)1.5 μL；FIP(40 μmol·L)1 μL；BIP(40 μmol·L)1 μL；F3(10 μmol·L)0.5 μL；B3(10 μmol·L)0.5 μL；LB(10 μmol·L)2 μL；模板2 μL；钙黄绿素(1.25 mmol·L)或羟基萘酚蓝(3 mmol·L)1 μL；ddHO 4.5 μL。

2.2 LAMP反应条件

采用2.1节反应体系进行最佳反应温度筛选，结果如图1-a所示，LAMP体系在60、62、64、65、66 ℃等5个反应温度下均有扩增，扩增产物在琼脂糖凝胶电泳检测下呈梯形条带，其中65 ℃条件下条带最为清晰，确定LAMP体系最佳反应温度为65 ℃。

采用2.1节所列反应体系进行最佳反应时间筛选，结果如图1-b所示，LAMP体系在30、40、50、60、70 min 5个反应时间下均可扩增，其中，30、40 min 2个反应时间下条带较为模糊，50、60、70 min 3个反应时间下条带较为清晰，反应60 min时条带最为清晰明亮，确定LAMP体系最佳反应时间为60 min。

2.3 LAMP可视化检测分析

反应条件为65 ℃恒温水浴60 min，反应结束后，观察颜色变化，并进一步用2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。反应效果如图2所示，斯高维尔炭疽菌LAMP扩增产物出现特有的梯形条带，阴性反应无条带出现，在羟基萘酚蓝指示剂的作用下，阳性显蓝色，阴性显紫色，在钙黄绿素指示剂的作用下阳性结果为绿色，阴性结果为橘黄色，可视化程度高。

M:DL2000 marker。a：LAMP体系不同反应温度的扩增结果；1，阴性对照；2，60 ℃；3，62 ℃；4，64 ℃；5，65 ℃；6，66 ℃。b：LAMP体系不同反应时间的扩增结果；1，阴性对照；2，30 min；3，40 min；4，50 min；5，60 min；6，70 min。M:DL2 000 marker. a: Amplification results of LAMP system at different reaction temperatures; 1， negative control; 2， 60 ℃;3， 62 ℃; 4， 64 ℃; 5， 65 ℃; 6， 66 ℃.b: Amplification result of LAMP system with different reaction times; 1， negative control; 2，30 min; 3，40 min; 4，50 min; 5，60 min; 6, 70 min.图1 LAMP体系不同反应温度和时间的扩增结果Fig.1 Amplification results of LAMP system at different reaction temperature and time

a:LAMP产物琼脂糖凝胶电泳检测结果；b：LAMP产物羟基萘酚蓝显色结果；c：LAMP产物钙黄绿素荧光显色结果。1，阴性对照(-)；2，斯高维尔炭疽菌(+)；3，斯高维尔炭疽菌(+)；4，阴性对照(-)。a: LAMP product agarose gel electrophoresis detection results； b: LAMP product hydroxynaphthol blue color results； c: LAMP product calcein fluorescence color results. 1, negative control (-); 2, Colletotrichum scovillei (+);3, Colletotrichum scovillei (+); 4, negative control (-).图2 LAMP反应体系检测斯高维尔炭疽菌Fig.2 LAMP reaction system for detecting Colletotrichum scovillei

2.4 试剂盒特异性试验分析

根据试剂盒应用方法进行检测，分别以斯高维尔炭疽菌菌株和对照菌株的DNA为模板进行LAMP扩增反应，斯高维尔炭疽菌DNA为阳性对照，灭菌的超纯水为阴性对照。

选用钙黄绿素作为指示剂，结果表明，在钙黄绿素指示剂的作用下，65 ℃恒温水浴60 min，3个斯高维尔炭疽菌LAMP产物均显示绿色，而其他的对照菌株LAMP产物均显示橘黄色(图3-a)。取2 μL扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果仅斯高维尔炭疽菌LAMP扩增产物出现特有的梯形条带，其他对照菌株则没有出现任何条带(图3-b)。

在羟基萘酚蓝指示剂的作用下，65 ℃恒温水浴60 min，3个斯高维尔炭疽菌LAMP产物为蓝色，而其他对照菌株LAMP产物均显示紫色(图4-a)。取2 μL扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果仅斯高维尔炭疽菌LAMP扩增产物出现特有的梯形条带，其他对照菌株则没有出现任何条带(图4-b)。进一步表明本研究建立的LAMP方法对斯高维尔炭疽菌具有很好的特异性，容易辨别。

M：DL2000 DNA marker。a: LAMP产物钙黄绿素荧光显色结果; b: LAMP产物琼脂糖凝胶电泳检测结果。1，阴性对照；2～4，斯高维尔炭疽菌；5，胶孢炭疽菌；6～8，喀斯特炭疽菌；9～10，水稻稻瘟病菌；11～12，刺梨叶斑病菌。M: DL2000 DNA marker。a: LAMP product calcein fluorescence coloring result; b: LAMP product agarose gel electrophoresis detection result. 1， Negative control; 2-4， Colletotrichum scovillei; 5， Colletotrichum gloeosporioides; 6-8， Colletotrichum karstii; 9-10， Magnaporthe oryzae; 11-12， Aclinonema sp.图3 钙黄绿素指示下LAMP方法的特异性Fig.3 Specificity of LAMP method under the indication of calcei

M：DL2000 DNA marker。a: LAMP产物羟基萘酚蓝显色结果；b: LAMP产物琼脂糖凝胶电泳检测结果。1，阴性对照；2～4，斯高维尔炭疽菌；5，胶孢炭疽菌；6～8，喀斯特炭疽菌；9～10，水稻稻瘟病菌；11～12，刺梨叶斑病菌。M: DL2000 DNA marker。 a: LAMP product hydroxynaphthol blue color result; b: LAMP product agarose gel electrophoresis detection result. 1， Negative control; 2-4，Colletotrichum scovillei; 5， Colletotrichum gloeosporioides; 6-8， Colletotrichum karstii; 9-10， Magnaporthe oryzae; 11-12，Aclinonema sp.图4 羟基萘酚蓝指示下LAMP方法的特异性Fig.4 Specificity of LAMP method under the indication of hydroxynaphthol blue

3 结论与讨论

本研究建立了果蔬斯高维尔炭疽菌特异扩增的LAMP检测方法，本方法特异性强，反应时间60 min，在钙黄绿素和羟基萘酚蓝2种染料下均可进行显色反应，条带清晰，表明本研究研制的基于LAMP的检测方法能成功应用于果蔬斯高维尔炭疽菌样品组织检测，特异性好且可视化。此外，环引物的加入能够加快反应速度，但会影响检测效果，其应用有待进一步研究。LAMP检测具有高灵敏度，但易受大气气溶胶污染，增加了产生假阳性的风险，在操作过程中要尽量避免假阳性的出现。传统的提取法虽然DNA浓度和纯度均较高，但操作步骤复杂，且易交叉污染。汪少丽等采用不开盖检测方法，将染料在反应前加入到PCR管内盖上，能够有效防止气溶胶污染，本实验也采用石蜡油进行封闭，少开盖，尽量避免假阳性的产生。史亚娟等用LAMP检测发现假禾谷镰刀菌扩增范围是61～66 ℃。汪少丽等对轮纹病菌检测发现，62～68 ℃均能扩增出条带。本研究检测斯高维尔炭疽菌的扩增温度是60～66 ℃，最佳温度为65 ℃，与以上研究结果相符，说明LAMP对温度要求较低，范围较广。本研究建立了斯高维尔炭疽菌LAMP检测体系，与传统组织分离法和PCR鉴定方法相比，具有高效便捷、特异性好、可视化等优势，不需要专门的检测仪器，使检测实地应用成为可能。本研究所得结果为斯高维尔炭疽菌的检测和其引起的果蔬炭疽病防治提供了技术支撑，同时为其他病原菌的快速检测方法研究提供了参考。