绛红小单孢菌突变株CH20190225-107的选育与鉴定

葛祥斌 徐鹏 刘阳 孟晓妍 叶晖 杨春敬 董宏伟

(福安药业集团烟台只楚药业有限公司，烟台 264001)

庆大霉素(gentamicin)是一种常见的氨基糖苷类抗生素，由绛红小单孢菌(Micromonospora purprua)发酵产生，绛红小单孢菌属于放线菌目小单孢菌属，革兰氏阳性菌[1]。由于绛红小单孢菌遗传性能稳定、不易突变、对诱变因素耐受性高等特点，因此传统的化学诱变方法较难得到高产菌株。

ARTP(常温等离子体诱变)是一种近年来发展起来的诱变方法，ARTP通过射频辉光放电能产生各种高能活性离子，这些离子能改变细菌细胞壁和细胞膜的通透性，损伤到细菌的遗传物质，从而引起菌株突变，具有安全性高、操作简便、正突变率高、稳定性好等优点[2-3]。

本研究所用的出发菌株为本公司(福安药业集团烟台只楚药业有限公司)冷冻管保存的绛红小单孢菌GM20190109-15，其效价为1547 U/mL，组分C1、C1a、C2a、C2分别为24%、26%、25%、25%。采用ARTP结合氯化锂化学诱变的方法对庆大菌株进行诱变[4]，采用酶标仪检测吸光度的方法进行高通量初筛，经复筛得到绛红小单孢菌突变株CH20190225-107，其效价为2280 U/mL，组分C1、C1a、C2a和C2的相对比例分别为29%、23%、25%和23%，突变株发酵单位较出发菌株提高了47.4%。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 出发菌株

本公司(福安药业集团烟台只楚药业有限公司)-80℃低温储存的绛红小单孢菌GM20190109-15。

1.2 试剂配制

45%氢氧化钠溶液：称取90 g氢氧化钠，加入110 mL重蒸水中溶解。

0.4 mol/L硼酸(pH 10.4)：称取6.183 g硼酸，加入100mL重蒸水溶解，定容至250 mL，使用45%氢氧化钠溶液调节pH至10.4。

邻苯二甲醛(OPA)衍生试剂：称取2.5 g OPA加入12.5 mL甲醇中溶解，加入237.5 mL 0.4 mol/L硼酸(pH 10.4)和5 mL巯基乙酸，使用45%氢氧化钠溶液调节pH至10.4。

水相：称取5.5 g庚烷磺酸钠，加入240 mL重蒸水溶解。

20%氯化锂：称取20 g氯化锂，加入80 mL重蒸水溶解。

0.9%生理盐水：称取0.9 g氯化钠，加入50 mL重蒸水溶解，定容至100mL。

20%硫酸：量取20 mL浓硫酸，加入80 mL重蒸水中，边搅拌边缓慢加入。

1.1.3 培养基配制

斜面培养基(1L)：琼脂条12 g，麸皮12 g，可溶性淀粉7.5 g，天冬酰胺0.02 g，硫酸镁0.5 g，氯化钠0.5 g，硝酸钾1 g，磷酸氢二钾0.3 g，碳酸钙1 g，调节pH至7.5，121℃高压蒸汽灭菌25 min。

种瓶培养基的配制(1L)：可溶性淀粉6.25 g，蛋白胨5 g，玉米粉15 g，黄豆饼粉18.8 g，葡萄糖1 g，硝酸钾0.6 g，氯化钴0.24 mL(浓度为1.2 μg/mL)，碳酸钙6.25 g，调节pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌30 min。

发酵培养基的配制(1L)：淀粉37 g，蛋白胨4 g，玉米粉11.5 g，黄豆饼粉35 g，葡萄糖2 g，硝酸钾0.185 g，硫酸铵1 g，氯化钴2 mL(浓度为10 μg/mL)，碳酸钙3 g，调节pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌30 min。

分离培养基(1L)：琼脂条12 g，可溶性淀粉7.5 g，天冬酰胺0.02 g，硫酸镁0.5 g，氯化钠0.5 g，硝酸钾1 g，磷酸氢二钾0.3 g，碳酸钙1 g，调节pH至7.5，121℃高压蒸汽灭菌25 min。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株活化

取绛红小单孢菌GM20190109-15冷冻管孢子，吸取100 μL接种于斜面培养基上进行孢子培养，培养温度为35.5℃，培养时间为10 d。

1.2.2 孢子悬浮液制备

挖取1.0 cm2活化后的孢子加入含5 mL灭菌0.9%生理盐水的三角瓶中，震荡20 min，得到孢子悬液。

1.2.3 ARTP和氯化锂复合诱变

取500 μL孢子悬液，加入20%氯化锂250 μL，0.9%生理盐水250 μL，震荡混匀5 min，得到含5%氯化锂的孢子悬液；震荡混匀后，用移液枪吸取20 μL含5%氯化锂的孢子悬液置于ARTP诱变样品器中进行诱变，调节诱变参数：诱变高度2 mm、气体流量12 slm，诱变时间分别设置为20、40、60、80、100、120、140和300 s，开始诱变。

1.2.4 分离

将诱变后的孢子悬液和未诱变的孢子悬液分别稀释至10-4、10-5、10-6和10-7，分别取100 μL诱变后的孢子悬浮液，涂布于含有分离培养基的培养皿中，温度为35.5℃、湿度为55%～65%下培养10～12 d，得到诱变后的单菌落，并计算致死率。

致死率(%)=(未诱变的菌落数-诱变的菌落数)/未诱变的菌落数×100%

1.2.5 高通量筛选

用灭菌的牙签挑取单菌落，接种于装有种瓶培养基的24孔板上，35.5℃、220 r/min下培养42 h。之后吸取600 μL种瓶培养基接种于发酵孔板上，35.5℃、220 r/min下培养96 h，同时吸取100 μL接种于斜面孔板，35.5℃下培养10 d。发酵孔板长成后，使用20%硫酸酸化发酵液至pH1.5～2.0，混匀后静置20 min，3000 r/min离心20 min，吸取上清20 μL置于96孔板中，加入160 μL OPA衍生试剂、820 μL重蒸水， 60℃水浴15 min，之后吸取200 μL衍生后的发酵液加入96孔玻璃板中，酶标仪检测吸光度，震荡5s，设置检测波长为325 nm。

1.2.6 发酵摇瓶筛选

经过“1.2.5”项下筛选得到数据较高的单菌落，从斜面孔板传茄瓶斜面，在温度为35.5℃、湿度为55%～65%下培养10～12 d。后挖取1.0 cm2孢子接入种子瓶中，35.5 ℃，220 r/min下培养42 h，在超净工作台中吸取10 mL菌丝种子，接入接发酵摇瓶，35.5℃，220 r/min下培养96 h。

1.2.7 高效液相色谱检测

将发酵摇瓶中的发酵液酸化至pH1.5～2.0，混匀静置20 min，过滤取上清液，衍生化步骤同“1.2.5”所示，采用高效液相色谱仪检测效价及组份。液相条件：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18，柱温为30℃，流动相为甲醇:水相:乙酸=710:240:50(V/V/V)，流速1.5 mL/min，检测波长为330 nm。

1.2.8 稳定性考察

对筛选出来的高产菌进行连续传代培养，考察突变菌株的遗产稳定性。在超净工作台上用2#棒轻蹭孢子，接种在3支空白斜面培养基上，温度为35.5℃、湿度为55%～65%下培养10～12 d，长成后，挖取1.0 cm2孢子接种子摇瓶中，之后接发酵摇瓶，培养条件同上，使用高效液相色谱的方法检测发酵液的效价及组份，重复上述工作4次。

1.2.9 生长特性分析

(1) pH对突变株生长的影响

取培养成熟的突变菌株茄瓶斜面，制成孢子悬液，稀释至10-6。用移液枪吸取100 μL分别接种于pH分别为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0的含斜面培养基的培养皿中，并设置3个平行，35.5℃培养6～10 d，每天记录菌落数。

(2) 温度对突变株生长的影响

取稀释至10-6的孢子悬液，用移液枪吸取100 μL接种于含斜面培养基的培养皿中。温度设置为28℃～38℃，设置10个梯度，每个梯度做3个平行，培养6～10d。缩小范围后，再对长出菌落的温度范围设置10个梯度，每个梯度做3个平行，培养6～10 d。每天记录菌落数。

(3) 湿度对突变株生长的影响

取稀释至10-6的孢子悬液，用移液枪吸取100 μL分别接种于含斜面培养基[pH为“1.2.9(1)”的最适pH]的培养皿中，湿度分别设置为35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%和70%，设置3个平行，在“1.2.9(2)”的温度下培养6～10 d，每天记录菌落数。

(4)突变株的培养时间确定

取稀释至10-6的孢子悬液，配制10个分离培养基[pH为“1.2.9(1)”的最适宜pH值]，取100 μL孢子悬液接种于这10个培养基中，在“1.2.9(2)”的温度下，“1.2.9(3)”的湿度下培养，每天记录菌落数，至不再长出菌落为止。

2 实验结果

2.1 高通量突变株筛选

庆大霉素衍生物，借助酶标仪，在波长为325 nm下，检测吸光度，其吸光值与庆大霉素效价呈线性关系，吸光值越大，庆大霉素效价越高，该方法可以快速检测大量样品。通过对192个样品的检测，最终筛选出6株吸光度较高的菌落，结果如表1所示。对这6株菌落进行发酵摇瓶复筛，高效液相色谱仪检测，得到CH20190225-107菌株，其效价有较大提高，C1提高较大，C1a降低明显，液相数据如表2所示。

表1 初筛6个菌株与出发菌株的吸光度比较Tab.1 The data of high throughput screening

表2 突变菌株与出发菌株效价及C1、C1a、C2a、C2对比Tab.2 Comparison of the titer and composition of mutant strains with original strains

2.2 突变菌株菌落形态特征

突变株CH20190225-107形态如图1(a)，出发菌株GM20190109-15形态如图1(b)，两者差异较大。突变株菌落扁平光滑、半透明、圆形、呈橙黄色，直径3 mm左右，出发菌株菌落隆起、盘卷蜡样、圆形、呈黑色，边缘有棕色圈，直径2 mm左右。

2.3 ARTP和氯化锂共同作用合适条件的考察

通过对绛红小单孢菌孢子悬液进行ARTP和氯化锂的复合诱变处理后，通过计算致死率来确定诱变时间。诱变时间与致死率的数据如表3，曲线如图2所示，随着诱变时间的增加，致死率显著上升，60s时达到92%，当诱变时间达到100 s以上时，致死率达到100%，因此选择60 s作为最适诱变时间。

表3 ARTP和氯化锂复合诱变的最适条件Tab.3 The optimal conditions for combined mutagenesis of ARTP and lithium chloride

2.4 突变株的稳定性考察

对CH20190225-107连续传5代，每代均使用高效液相色谱仪检测效价及组分，结果显示稳定性良好，如表4所示，各组份的出峰时间与出发菌株一致，如图3所示，说明该突变株高产及组分C1提高、C1a降低的特性具有遗传稳定性，具备产业化生产能力。

表4 CH20190225-107菌株5代发酵单位与组分数据的比较Tab.4 Comparison of 5 liquid phase data of CH20190225-107 strain

2.5 斜面生长条件研究

原始菌株GM20190109-15的最适生长条件为：斜面培养基最适pH为7.5，培养温度为35.5℃～36.5℃，湿度为55%～65%，培养时间为10 d。而在对突变株CH20190225-107的pH、温度、湿度、生长时间进行研究，发现其斜面最适生长条件为：培养基pH为7.0、温度为37℃、湿度为55%、培养时间为3d，如图4所示。与原始菌株相比，突变菌株的最适pH有所下降，培养温度有所提高，湿度基本保持不变，培养时间大幅下降。

2.6 50 L发酵罐发酵结果分析

50 L发酵罐发酵工艺，将斜面菌种制成孢子悬液，接种到15 L种子罐，接种量为0.1%，培养64 h后接种到50 L发酵罐，接种量为30%，发酵周期为96 h。培养温度36℃，通气量1:1 vvm，罐压0.02 MP，发酵过程中用30%NaOH溶液维持pH7.0，发酵罐接种后每24 h检测1次庆大霉素效价。在50 L发酵罐上对突变株CH20190225-107发酵效价和组分进行验证，同时以出发菌株GM20190109-15为对照，考察突变株的庆大霉素效价变化和产品组分情况。发酵过程中庆大霉素效价如表5，曲线如图5所示，产品组分如表6。突变株CH20190225-107的96 h放罐效价较出发菌株GM20190109-15提高了52.6%，C1提高了20.8%，C1a降低了21.4%。突变株CH20190225-107在发酵过程中表现出较强的生物活性，随着发酵周期的延长，庆大霉素效价具有明显的上升趋势。

表6 突变株与出发菌株株组分变化比较(50L发酵罐)Tab.6 Comparison of component changes between mutant strain and original strain (50L fermentor)

表5 突变株与出发菌株发酵周期与发酵单位的比较(50 L发酵罐)Tab.5 Comparison of fermentation cycle and fermentation unit between mutant and original strain (50 L fermentor)

3 结果与展望

采用ARTP和氯化锂复合诱变的方法，对绛红小单孢菌进行处理，得到了高产菌株，提高庆大霉素产量和质量。绛红小单孢菌的细胞壁较厚，耐诱变因素强[5]，而ARTP技术可以增加细胞壁的通透性，有利于诱变剂的进入，氯化锂这种弱诱变剂，适合和其它诱变方式配合使用，对含有5%氯化锂的孢子悬浮液，使用ARTP诱变60 s，可以使正突变率达到最高。本研究得到的突变菌株CH20190225-107，其摇瓶效价提高了47.4%、C1提高17.8%、C1a降低12.5%，经稳定性考察其性状能够稳定遗传。突变菌株CH20190225-107在50 L发酵罐中，表现出中后期生物活性强、效价高、产品质量好的特点。该突变株经过培养基和培养条件优化后，在产业化生产中发酵效价会进一步提高。