一测多评测定菝葜中4种成分*

王伟影 陈梦 毛菊华 陈卫平

(丽水市质量检验检测研究院，浙江 丽水 323000)

菝葜为2020年版《中国药典》一部收载品种[1]，药用部位为百合科植物菝葜SmilaxchinaL.的干燥根茎，具有利湿去浊、祛风除痹，解毒散瘀的功效，用于治疗小便淋浊，带下量多，风湿痹痛，疔疮痈肿。现行法定标准缺少指标性成分含量测定[1]；现有菝葜及相关制剂的化学成分定量研究主要集中在落新妇苷、黄杞苷、槲皮素、薯蓣皂苷元等[2-10];相关药理学研究显示，菝葜在抗炎、抑制肿瘤、免疫抑制等方面具有优良的作用[11-16]。本文综合考虑菝葜的药理研究和化学成分研究，选取了具有良好的抗菌消炎和抗肿瘤等活性的绿原酸、有抗菌消炎作用的原儿茶酸、在免疫抑制方面有明显作用的落新妇苷和用于肿瘤抑制白藜芦醇等4种成分，以绿原酸为内参物，建立QMAS法菝葜中上述4种成分的测定方法，以期为菝葜的质量评价提供一种经济、高效的多指标质控方法。

1 仪器与试药

1.1仪器 安捷伦1260高效液相色谱仪，配DAD检测器(美国安捷伦公司)；XS105DU电子天平(瑞士梅特勒公司)；Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(4.6mm×250 mm，5 μm) (美国安捷伦公司)；DKS24恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；Lc-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Agilent ZorbaxSB-C18色谱柱(4.6mm×250 mm，5 μm) (美国安捷伦公司)；Phenomenex Luna C18色谱柱(4.6mm×250 mm，5 μm) (美国Phenomenex公司)；Inertsil ® ODS-3 C18色谱柱(4.6mm×250 mm，5 μm)(日本岛津公司)。

1.2试药 绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110753-201817，质量分数：96.8%)；原儿茶酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110809-200604，质量分数：100.0%)；落新妇苷对照品(上海安谱实验科技股份有限公司，批号：V7840010，质量分数：99.8%)；白藜芦醇对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110535-200301，质量分数：100.0%)；甲醇，乙腈为色谱纯；磷酸，乙醇为分析纯；水为自制纯化水。

菝葜药材(见表1)，市场购入，经由丽水市质量检验检测研究院王建伟副主任中药师鉴定均为2020年版《中国药典》收载品种百合科植物菝葜SmilaxchinaL.的干燥根茎，分别粉碎，过三号筛，备用。

表1 菝葜药材一览

2 方法与结果

2.1色谱条件 AgilentEclipse PlusSB-C18(4.6mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相为乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～10 min，A 10%→15%；10～20 min，A 15%→25%；20～28 min，A 25%→30%；28～35 min，A 30%→40%；35～50 min，A 40%→70%)，流速为1.0 mL·min-1；柱温35 ℃；检测波长为306 nm；进样量为5 μL；理论塔板数按绿原酸、原儿茶酸、落新妇苷与白藜芦醇计均不得低于5000。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、原儿茶酸、落新妇苷与白藜芦醇对照品适量，分别加甲醇制成每1 mL含绿原酸573.06 μg、原儿茶酸223.00 μg、落新妇苷543.41 μg、白藜芦醇218.60 μg的溶液，作为储备液。精密吸取4种储备液制成每1 mL含绿原酸57.31 μg、原儿茶酸22.30 μg、落新妇苷54.4 μg、白藜芦醇21.86 μg的混合溶液，作为对照品溶液(各成分均已按其质量分数折算)。

2.2.2供试品溶液的制备 取本品粉末约1.0 g，精密称定，置磨口锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定重量，90～95 ℃水浴中回流提取60 min，放冷至室温，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.3方法学考察

2.3.1系统适用性实验 取“2.2.1”与“2.2.2”项下溶液，按 “2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，见图1。由图1可知，绿原酸、原儿茶酸、落新妇苷、白藜芦醇与其他成分均可达到基线分离，分离度均>1.5，理论塔板数均>10 000，分离效果良好。用 DAD检测器进行峰纯度检查，纯度因子均满足阈值限值要求(阈值为 990)。

A.对照品；B.菝葜；1.原儿茶酸；2.绿原酸；3.落新妇苷；4.白藜芦醇

2.3.2线性关系考察 吸取混合对照品溶液1，2，5，8，10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以峰面积Y对进样质量X进行线性回归，结果见表2。

表2 4种成分的线性关系、检出限、定量限

2.3.3精密度实验 取“2.2.1”项下溶液，按“2.1” 项下色谱条件测定，连续进样6次，记录峰面积并计算RSD。结果，4种成分峰面积的RSD为0.65%～1.62%，表明仪器精密度良好。

2.3.4稳定性实验 取同一供试品溶液，分别在0、6、12、18、24、36 h按“2.1” 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算RSD。结果，4种成分峰面积RSD为0.97%～1.35%，表明供试品溶液在制备后36 h内稳定性良好。

2.3.5重复性实验 取BQ-1样品，平行取样6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1” 项下色谱条件测定，计算各成分含量。结果，4种成分质量分数的RSD为0.89%～1.26%，表明该测定方法具有良好的重复性。

2.3.6回收率实验 取已知含量的菝葜(BQ-1)6份，各约0.5 g，精密称定，置磨口锥形瓶中，分别精密加入绿原酸、原儿茶酸、落新妇苷和白藜芦醇对照品储备液溶液0.5、1.0、0.5、0.5 mL和70%乙醇47.5 mL，按“2.2.2”项下方法制备回收率试液，按“2.1”色谱条件测定，测定各成分的含量，计算回收率。结果，4种成分的平均加样回收率为100.38%～100.72%、RSD为0.72%～1.43%，表明该测定方法准确度良好，方法可行。

2.4相对校正因子(RCF)的确定

2.4.1RCF的计算 取“2.2.1”项下溶液，分别进样1、2、5、8、10、20 μL，按“2.1” 项下色谱条件测定，以绿原酸为内参物，按公式

计算原儿茶酸、落新妇苷和白藜芦醇的RCF，结果见表4。

表4 菝葜中3种成分的RCF

2.4.2RCF重现性考察 取“2.2.1”项下溶液，按“2.1” 项下色谱条件进样测定，分别考察安捷伦1260、岛津Lc-20AT高效液相色谱仪和4.6 mm×250 mm，5 μm规格的4根色谱柱(Agilent Eclipse Plus C18、Agilent ZorbaxSB-C18、Phenomenex Luna C18、Inertsil ® ODS-3 C18)对原儿茶酸、落新妇苷和白藜芦醇的RCF的影响，结果见表5，RSD均小于2%，表明该方法重现性好。

表5 不同高效液相色谱仪、不同色谱柱测得的RCF

2.4.3RCF的确定 依据相关技术指南和相关研究[17-20]，综合考虑影响RCF的因素，取“2.4.1”与“2.4.2”试验所得的所有RCF的平均值，最终确定原儿茶酸、落新妇苷和白藜芦醇的RCF分别为2.340、1.566、0.307，RSD分别为1.38%(n=14)、1.58%(n=14)、1.33%(n=14)。

2.5待测组分色谱峰的定位 取“2.2.1”项下溶液，按“2.1” 项下色谱条件进样，分别考察安捷伦1260、岛津Lc-20AT高效液相色谱仪和同样为4.6 mm×250 mm，5 μm规格的4根色谱柱(Agilent Eclipse Plus C18、Agilent Zorbax SB-C18、Phenomenex Luna C18、Inertsil ® ODS-3 C18)，测定并计算待测组分原儿茶酸、落新妇苷和白藜芦醇与内参物绿原酸的相对保留值(RRT)，结果见表6。结果表明原儿茶酸、落新妇苷和白藜芦醇的相对保留值波动较小，RSD均小于5%(n=8)。

表6 不同色谱仪、不同色谱柱测得各成分的相对保留值

2.6QAMS与ESM测定结果的比较 按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，分别采用QAMS法与ESM法计算绿原酸、原儿茶酸、落新妇苷和白藜芦醇的含量，结果见表7。ESM法实测值与QAMS计算值的相对误差(RE)小于3%，表明2种方法得到的结果无显著差异，说明本试验建立的以绿原酸为内标的QAMS法在菝葜的多指标成分定量分析和质量评价中应用是适用的、可行的。

表7 QAMS与ESM测定结果比较(n=2)

3 讨论

参考相关研究[2-4,8]，发现以乙腈-水系统加入少量磷酸分离效果较理想且峰形较佳、分析时间短；预实验采用多波长同时测定，结合190～400 nm波段紫外扫描的结果，确定306 nm作为检测波长。所建立的色谱条件下，绿原酸、原儿茶酸、落新妇苷和白藜芦醇4种成分的分离效果均良好。本实验所选的绿原酸、原儿茶酸、落新妇苷和白藜芦醇4种物质中，绿原酸性质稳定且最价廉易得，故选择其作为内参物进行QAMS的分析。试验结果显示，绿原酸作为该QAMS的内参物是适宜的。

QAMS应用的前提是色谱峰的准确定位，一般采用相对保留值(RRT)或保留时间差等方式定位色谱峰。本试验选择RRT作为考察参数，结果显示绿原酸、原儿茶酸、落新妇苷和白藜芦醇4种物质在不同品牌、相同品牌不同类型的色谱柱中均有良好的稳定性，RRT波动小，所建立的方法适用性良好。

本试验所建立的QAMS与ESM法在菝葜的绿原酸、原儿茶酸、落新妇苷和白藜芦醇4种成分含量测定中无显著差异，该QAMS法实现一种价廉对照品同步测定4种成分，为菝葜的质量评价提供了一种经济、高效、实用的多指标质控方法。