慢性乙型病毒性肝炎患者血清25-羟基维生素D3水平与外周血T淋巴细胞亚群相关性分析

栗红江， 胡素玲， 刘 洋， 孙静玮， 耿坤静

保定市人民医院1.消化三科；2.功能科；3.检验科；4.健康管理中心，河北 保定 071000

慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是世界范围内的流行性传染病，全球每年约有100万人死于CHB相关的肝衰竭或肝细胞癌[1]。CHB患者肝病变发展与抗病毒效果取决于免疫应答的性质、强度和范围，有效的T细胞应答是控制病毒感染的关键[2]。但目前，有关T淋巴细胞对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)产生免疫耐受的机制尚不明确。维生素D参与细胞的增殖、分化，对机体免疫系统有一定的调节作用，且CHB患者普遍存在维生素D缺乏或不足[3]。有研究发现，慢性丙型病毒性肝炎患者采用聚乙二醇干扰素联合利巴韦林抗病毒的治疗效果会受到维生素D水平的影响，维生素D缺乏可能是造成抗病毒治疗无应答的原因之一[4]。维生素D对慢性丙型病毒性肝炎治疗的效果影响也推动了其在CHB中的研究，并发现维生素D对CHB的影响可能与维生素D的免疫调节功能有关，正常维生素D水平的CHB患者乙肝e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)转阴率更高[5]。此外，循环血T淋巴细胞亚群与CHB患者细胞免疫状态有明显关联，是影响机体对HBV清除能力与肝纤维化情况的重要因素，但有关CHB患者维生素D水平与肝纤维化、外周血T淋巴细胞亚群的关系研究少见报道。饮食来源和皮肤合成的维生素D前体在肝中于25羟化酶作用下进行羟化反应形成25羟维生素D3[25-dihydroxyvitam in D3，25(OH)D3]，是血液循环中维生素D的主要形式。本研究旨在探讨CHB患者血清25(OH)D3水平与肝纤维化进展及外周血T淋巴细胞亚群的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取自2018年5月至2020年4月保定市人民医院收治的140例CHB患者为研究对象。纳入标准：(1)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[6]中CHB的诊断标准；(2)无抗病毒药物及免疫调节剂治疗史；(3)无甲、丙等其他肝炎感染者；(4)无长期饮酒史；(5)均行肝穿刺病理活检；(6)患者签署知情同意书。排除标准：(1)入组前半年内服用过钙剂、维生素D制剂、二磷酸盐、降钙素、雌激素、糖皮质激素者；(2)伴心、脑、肾等器官功能不全者；(3)伴糖尿病、骨质疏松等可能影响维生素D水平的疾病者；(4)伴酒精性或脂肪性肝病、遗传代谢性肝病、药物性肝病、自身免疫性肝病者；(5)伴胆汁淤积性疾病、肝血液循环障碍性疾病者。根据血清25(OH)D3水平将患者分为严重缺乏组[25(OH)D3<10 ng/ml，n=45]、不足组[25(OH)D3 10～30 ng/ml，n=55)和充足组[25(OH)D3>30 ng/ml，n=40]。严重缺乏组中，男性23例，女性22例；平均年龄(35.89±5.63)岁；HBV感染时间(9.54±3.16)年。不足组中，男性30例，女性25例；平均年龄(33.65±5.28)岁；HBV感染时间(10.29±3.33)年。充足组中，男性22例，女性18例；平均年龄(35.76±5.61)岁；HBV感染时间(10.62±3.52)年。各组患者一般资比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 血清学指标检测 于晨起空腹状态下采集5 ml外周静脉血，3 500 r/min离心10 min，留取分离血清待测。采用贝克曼AU680全自动生化分析仪检测谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、总胆红素(total bilirubin，TB)，其中ALT、AST检测试剂购自新健康成生物股份有限公司；TB试剂购自北京瑞正医疗科技有限公司。采用电化学发光法(罗氏ROCHE E601及配套试剂)检测血清HBeAg，Cut off指数<1.0为阴性，否则为阳性。采用上海宏石全自动荧光定量PCR仪SLAN-96P检测HBV-DNA，检测试剂购自圣湘生物。采用流式细胞术(迈瑞BriCyte E6流式细胞仪及配套试剂)检测T淋巴细胞亚群。采用衍射光谱法(奥林巴斯AU680全自动生化分析仪)测定25(OH)D3，检测试剂购自北京九强生物。所有检测均严格按说明书操作。

1.2.2 肝纤维化检测 采用Fibroscan测定肝弹性测量值(liver stiffness measurement，LSM)，判定肝纤维化程度[7]：对于TB正常且转氨酶异常者，LSM≥17.5 kPa为肝硬化，12.4～17.5 kPa为进展性肝纤维化，9.4～12.4 kPa为显著肝纤维化，7.4～9.4 kPa为轻度肝纤维化，LSM<7.4 kPa为无肝纤维化；对于转氨酶及TB均正常者，LSM≥12.0 kPa为肝硬化，9.0～12.0 kPa为进展性肝纤维化，6.0～9.0 kPa为轻度肝纤维化，LSM<6.0 kPa为无肝纤维化。

2 结果

2.1 各组患者血清学指标比较 各组血清ALT、AST、TB及HBV-DNA比较，差异无统计学意义(P>0.05)。严重缺乏组HBeAg阳性率明显高于不足组和充足组，差异有统计学意义(P<0.05)。不足组与充足组HBeAg阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组患者血清学指标比较

2.2 各组患者外周血T淋巴细胞亚群比较 严重缺乏组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+T细胞低于不足组与充足组，且不足组低于充足组，差异有统计学意义(P<0.05)；严重缺乏组CD8+T细胞高于不足组与充足组，且不足组高于充足组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组外周血T淋巴细胞亚群比较

2.3 各组患者肝纤维化程度比较 严重缺乏组与不足组的进展性纤维化比例明显高于充足组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组患者肝纤维化程度比较/例(百分率/%)

2.4 相关性分析 CHB患者血清25(OH)D3与LSM呈负相关(r=-0.257，P<0.05)，与CD4+/CD8+呈正相关(r=0.227，P<0.05)；LSM与CD4+/CD8+呈负相关(r=-0.194，P<0.05)。

3 讨论

维生素D在细胞增生、分化、机体免疫功能、抗炎、抗纤维化等方面均有明显作用，可对慢性肝病的进展及治疗效果产生明显影响。有研究表明，维生素D受体可在人体肝、胰腺、消化道上皮细胞和单核细胞，以及巨噬细胞、T淋巴细胞等免疫细胞中表达[8]。维生素D受体被维生素D激活后会促进上述免疫细胞中维生素D合成酶的生成，将血清中低活性的维生素D转化为高活性的25(OH)D3，进而通过自分泌或旁分泌等途径调节免疫细胞功能[9]。

本研究结果显示，严重缺乏组的HBeAg阳性率明显高于不足组和充足组，提示较高水平的25(OH)D3有利于促进CHB患者的HBeAg自发清除，与既往研究[10]结果一致。CHB属于异质性疾病，不同患者的病毒复制水平有所不同，肝组织炎症轻重也各异，两者的平衡制约着感染的转归，反映机体的免疫状态，而免疫功能和病毒复制也决定了肝病变程度，较弱的免疫功能与较高水平的病毒复制能力会促进肝纤维化进展[11]。有效的T细胞应答对控制CHB患者的病毒感染与复制起关键作用，成为CHB的研究热点。T淋巴细胞亚群可分为效应性T细胞或调节性T细胞，T细胞总数或不同T细胞亚群绝对数及比值的变化常与疾病的发生及机体免疫功能强弱有关[12]。本研究中，严重缺乏组的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+T细胞低于不足组与充足组，且不足组低于充足组(P<0.05)；严重缺乏组CD8+T细胞高于不足组与充足组，且不足组高于充足组(P<0.05)，且血清25(OH)D3与CD4+/CD8+呈显著正相关，提示较低水平25(OH)D3的患者免疫功能也越差。有研究表明，初始T淋巴细胞的活化依赖维生素D水平，T淋巴细胞受到HBV刺激后表达的维生素D受体需在维生素D作用下形成复合体，从而激活T淋巴细胞，较低水平的25(OH)D3在激活T淋巴细胞后的增生指数较低，难以完全满足对HBV的杀灭作用，因此，CHB患者的25(OH)D3水平与CD4+/CD8+T细胞呈现出正相关性[13-14]。也有研究发现，维生素D还可抑制Th1型淋巴细胞的增生并抑制相关细胞因子分泌，使免疫应答向Th2型转变，以此减轻Th1型细胞应答产生的组织损伤[15]。

HBV感染后启动机体免疫反应，使CD8+T细胞与靶细胞接触，诱导CD8+T细胞杀伤靶细胞，但与此同时也在HBV致敏后释放颗粒酶和穿孔素，清除肝细胞内HBV的同时也会对肝细胞造成损伤，诱发肝组织炎症，激活肝星状细胞，促进胶原纤维合成与沉积，进而导致肝组织纤维化甚至进展为肝硬化[16-17]。随着CD8+T细胞的消耗，为了维持免疫平衡的稳态，机体CD8+T细胞的分泌速度也会加快，造成CD8+T细胞的上调，CD4+/CD8+减小。因此，CD4+/CD8+越小，机体免疫耐受越严重，肝纤维化也越重，使LSM与CD4+/CD8+呈显著负相关。有研究认为，CHB患者因HBV感染，长期处于免疫耐受状态，使机体免疫细胞数量及功能失衡，最终诱发肝组织持续炎症与肝纤维化[18]。本研究结果显示，严重缺乏组与不足组进展性纤维化患者的占比明显高于充足组，且血清25(OH)D3水平与LSM呈负相关，提示较低水平的血清25(OH)D3更易造成肝纤维化的出现与进展。以上结果说明，CHB患者的血清25(OH)D3水平与机体T淋巴细胞之间存在一定的相关性，通过该途径影响肝组织纤维化的进展，外源性补充维生素D有利于HBeAg的自发清除及强化免疫应答，从而减轻肝组织损伤并抑制肝纤维化进展。国外研究也表明，低水平25(OH)D3是重度肝纤维化的独立危险因素，外源性补充维生素D可调节钙磷代谢并抑制肝纤维化[19-20]，与本研究结果一致。

综上所述，CHB患者维生素D水平可能影响T淋巴细胞亚群，并通过该途径调控肝组织纤维化进展，未来需要更多的体内或体外研究来探讨具体机制。本研究不足之处：肝纤维化诊断分级依据较为单一，且Fibroscan易受检查者经验、肝炎症程度等因素影响，应进一步通过肝活检、血清学等联合检查提高肝纤维化的诊断准确性。此外，羟化酶CYP2R1、CYP27A1和CYP24A1等也会影响25(OH)D3代谢，但本研究未能进行分析，可能造成一定的偏倚，有待后续完善研究。