IL⁃17 诱导的p300 调控NSCLC 细胞迁移、侵袭和MMP2 表达的作用

李 雅，葛 文，张志伟，蒋馨怡，何庆玲，阮玉婷，吴宁霞，应 帅，王伟民，张 婧，邱 文，王迎伟*，赵晨卉

1南京医科大学免疫学系，江苏 南京 211166；2南京医科大学第一附属医院肿瘤科，江苏 南京 210029

肺癌是人类常见的恶性肿瘤，病理上分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（non⁃small cell lung cancer，NSCLC）两大类，后者约占临床病例的85%［1-2］。由于NSCLC发病率高，患者死亡又多与瘤细胞的侵袭转移有关，故研究NSCLC的转移机制极为重要。

NSCLC 发生发展与多种因素密切相关。近年来，关于肺部慢性炎症诱发NSCLC的文献日趋增多，其机制不仅涉及肿瘤局部促炎因子的表达上调［3］，而且某些因子还能诱导瘤细胞的侵袭和转移［4-5］。已知IL⁃17 是一种典型的促炎因子，其在多种肿瘤组织中的表达常显著上调［4-5］。本课题组以往的研究表明，在NSCLC 的癌组织内IL⁃17 及IL⁃17 受体（IL⁃17RA）的表达明显升高。体外用IL⁃17 刺激NSCLC细胞后也能诱导其增生、迁移与侵袭［6］。不过，其诱导细胞迁移与侵袭的分子机制并不清楚。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是Zn2+依赖的蛋白水解酶，可分为6大类28个成员，多由成纤维细胞和肿瘤细胞等合成，通过降解细胞外基质而促进肿瘤转移［4-5］。有资料显示，MMP2广泛表达，在乳腺癌转移中起增强效应［4-5］。本课题前期体外实验已发现，受IL⁃17刺激的NSCLC细胞中MMP2的表达显著增加。

已知腺病毒E1A 相关300 kDa 蛋白（adenoviral E1A binding protein of 300 kDa，p300）是一种转录辅激活因子［7］。研究证实，p300能促进NSCLC的迁移与侵袭，其机制与p300辅助修饰某些转录因子促进了靶基因的表达有关［7］。本课题前期研究表明，用IL⁃17刺激NSCLC细胞后，其胞内p300和MMP2的表达明显上调。因此，IL⁃17上调的p300是否能通过调控MMP基因表达增强NSCLC细胞的侵袭和转移，值得进一步探究。

1 材料和方法

1.1 材料

人正常支气管上皮细胞系BEAS⁃2B 和NSCLC细胞系（A549、PC9、H1299）由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。

胎牛血清（南京诺唯赞生物公司）；Lipofectamine 2000（赛默飞世尔科技公司，美国）；兔p300 多克隆抗体（CST 公司，美国）；兔MMP2 多克隆抗体（杭州华安生物公司）；小鼠β⁃actin 单克隆抗体（上海碧云天生物公司）；羊抗兔、鼠IgG⁃HRP 二抗（合肥Biosharp 公司）。siIL⁃17RA 购买于上海吉玛基因公司。

1.2 方法

1.2.1 BEAS⁃2B、A549、PC9和H1299细胞系的培养及IL⁃17RA的检测

将细胞接种于DMEM 完全培养液（10%胎牛血清）中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培养48 h。当细胞融合度达到90%时，按1∶5比例进行传代培养。

Western blot 实验：细胞裂解物离心3 min 取30 μg 蛋白行SDS⁃PAGE 电泳。电泳2 h 再湿转120 min。待蛋白转印到PVDF 后用脱脂牛奶封闭2 h，加IL⁃17RA一抗4 ℃过夜。用HRP 标记的二抗孵育1 h。最后行ECL化学发光试剂测定。

1.2.2 沉默IL⁃17RA基因后检测H1299细胞迁移和侵袭能力

培养H1299 细胞，待其生长融合度达80%时进行siIL⁃17RA质粒的转染。先用DMEM对4 μL lipo⁃fectamine 2000和2000 ng siIL⁃17RA 进行稀释，然后将二者混合后静置15 min 再加细胞，置37 ℃、5%CO2条件下继续培养。

细胞划痕实验：将转染siIL⁃17RA质粒的H1299细胞饥饿12 h 再行培养。当融合度达90%时，用200 μL 移液器吸头产生细胞单层的线性伤口，PBS清洗后加含1%FBS 的DMEM，同时加50 ng/mL 的IL⁃17。继续培养并在0 h和24 h观察其生长情况。

Transwell实验：将转染siIL⁃17RA的H1299细胞饥饿12 h 再接种至含1%FBS DMEM 的Transwell 小室中（5×104个/孔）。另下室加600 μL 相同的培养液。培养24 h 去除上清，并洗去未穿透膜的细胞。迁移到膜下的细胞行100%甲醇固定和0.1%结晶紫染色。显微镜下观察后拍摄5个随机选择的视野。

1.2.3 IL⁃17 刺激H1299 细胞后检测不同时间p300和MMP2的表达

收集IL⁃17 刺激后0、1、2、3、6、12 h 的H1299 细胞蛋白，行Western blot 检测p300 和MMP2 的表达，方法同前。

1.2.4 沉默IL⁃17RA基因后p300和MMP2蛋白表达的测定

将siIL⁃17RA质粒转染H1299细胞后48 h，再用IL⁃17 刺激3 h。用Western blot 检测p300 和MMP2的表达，实验分组及检查方法同前所述。

1.2.5 过表达或沉默p300 对细胞迁移、侵袭及MMP2表达的影响

1.2.5.1 p300 过表达和shp300 小干扰质粒的来源及验证

将p300 过表达质粒用Lipofectamine 2000 转染H1299 细胞48 h，实验分组为：①pcDNA3.1 组；②pcDNA3.1/p300 组。收集细胞蛋白行Western blot检查。

同样，将shp300 小干扰质粒转染细胞48 h，之后用IL⁃17 刺激3 h。实验分组为：①shCTR+IL⁃17组；②shp300⁃1+IL⁃17 组；③shp300⁃2+IL⁃17 组；④shp300⁃3+IL⁃17组。收集细胞蛋白行Westernblot检查。

1.2.5.2 过表达或沉默p300 对H1299 细胞迁移和侵袭的影响

实验分为：①pcDNA3.1 组；②pcDNA3.1/p300组；③shCTR+IL⁃17组；④shp300+IL⁃17组。检查时间点为0 h和24 h。具体方法同前。

1.2.5.3 过表达或沉默p300 影响H1299 细胞表达MMP2的测定

过表达p300 的分组为：①pcDNA3.1 组；②pcD⁃NA3.1/p300 组。沉默p300 的分组为：①shCTR 组；②shCTR+IL⁃17 组；③shp300+IL⁃17 组。用Western blot检查MMP2的表达，时间点选择见前所述。

1.3 统计学方法

所有实验均独立重复3次，数据以均数±标准差（）表示。采用SPSS 19.0 统计软件进行统计学分析，多组间比较则采用单因素方差分析，Bonfferoni法进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC细胞系IL⁃17RA的表达

为了证实NSCLC 细胞表面存在IL⁃17RA，检测了正常支气管上皮细胞BEAS⁃2B 及NSCLC 的3 种细胞系（A549、PC9和H1299）。结果显示，这些细胞均有IL⁃17RA 的表达，但NSCLC 细胞系表达更为明显，尤以H1299 细胞显著（图1），故后续选择H1299细胞系开展实验。

图1 IL⁃17RA在支气管上皮细胞（BEAS⁃2B）和NSCLC 细胞系（A549、PC9和H1299）中的表达Figure 1 The expression of IL⁃17RA in bronchi epithelial cell（BEAS⁃2B）and NSCLC cell line（A549，PC9 and H1299）

2.2 敲低IL⁃17RA 对IL⁃17 诱导的H1299 细胞迁移和侵袭的影响

为了确定IL⁃17 可通过结合IL⁃17RA 来影响H1299 细胞的迁移和侵袭，在转染了siIL⁃17RA 的H1299细胞中进行划痕和Transwell实验。结果发现，转染siIL⁃17RA质粒48 h后再用IL⁃17（50 ng/mL）刺激24 h，siIL⁃17RA+IL⁃17组的细胞迁移和侵袭能力均明显降低（图2）。

图2 敲低IL⁃17RA表达对IL⁃17诱导细胞迁移和侵袭的影响Figure 2 Influence of IL⁃17RA knockdown on IL⁃17⁃induced cell migration and invasion

2.3 IL⁃17 刺激H1299 细胞不同时间p300 和MMP2蛋白表达的变化

用前述剂量的IL⁃17刺激H1299细胞0、1、2、3、6、12 h，采用Western blot 检测p300和MMP2蛋白表达。IL⁃17 刺激后2 h，p300 和MMP2 的表达显著升高，3 h 时达到高峰（图3）。因此，后续选择了IL⁃17刺激细胞3 h作为蛋白检测的时间点。

图3 Western blot 检测IL⁃17 刺激H1299 细胞不同时间p300和MMP2的表达Figure 3 Expression of p300 and MMP2 at different time in H1299 cell stimulated with IL⁃17 by Western blot

2.4 敲低IL⁃17RA 表达对IL⁃17 诱导的H1299 细胞p300和MMP2表达的影响

为了明确p300 和MMP2 蛋白的表达确为IL⁃17刺激及IL⁃17结合IL⁃17RA所致，将H1299细胞转染siIL⁃17RA 48 h 再用IL⁃17 刺激3 h。结果显示，IL⁃17刺激细胞后3 h能显著上调p300和MMP2的蛋白表达，而siIL⁃17RA+IL⁃17组p300和MMP2的蛋白水平则显著减少（图4）。

图4 Western blot 检测敲低IL⁃17RA 影响p300 和MMP2的表达Figure 4 IL⁃17RA knockdown affects p300 and MMP2 expression by Western blot

2.5 过表达或敲低p300 对H1299 细胞迁移、侵袭及表达MMP2的影响

2.5.1 p300 过表达和shp300 质粒验证及shp300 有效沉默靶点的确定

将pcDNA3.1/p300过表达质粒和对照质粒分别转染H1299 细胞48 h（转染效率约70%），收集细胞蛋白检测p300 的表达。结果显示，转染pcDNA3.1/p300的细胞中，p300的表达显著增加（图5）。

将构建的3 个针对不同靶点的shRNAp300⁃1、shRNAp300⁃2、shRNAp300⁃3 质粒和其对照shCTR质粒分别转染H1299 细胞48 h 发现，shp300⁃2 能显著下调p300 蛋白的表达（图5），故后续选取了shp300⁃2进行实验，并统一简化命名为shp300。

图5 Western blot检测pcDNA3.1/p300和shp300质粒表达的验证Figure 5 Expression verification of pcDNA3.1/p300 and shp300 plasmids by Western blot

2.5.2 过表达或敲低p300 对H1299 细胞迁移和侵袭的影响

为了检查p300 基因对H1299 细胞迁移和侵袭的影响，在细胞转染p300 表达质粒和shp300 质粒后进行了划痕和侵袭实验。结果表明，转染pcDNA3.1/p300 质粒可增加细胞的迁移和侵袭能力，而转染shp300质粒48 h后再行IL⁃17刺激24 h，其迁移和侵袭能力均明显降低（图6）。

图6 过表达和敲低p300影响细胞的迁移与侵袭Figure 6 Effects of p300 overexpression and knockdown on cell migration and invasion

2.5.3 过表达或沉默p300 基因对H1299 细胞表达MMP2的影响

细胞转染质粒同前。Western blot 检测结果显示，转染pcDNA3.1/p300 组，MMP2 蛋白表达明显增加（图7A），但在shp300+IL⁃17组，MMP2的表达则显著降低（图7 B）。

图7 Western blot检测过表达或敲低p300对MMP2表达的影响Figure 7 Effects of p300 overexpression and knockdown on MMP2 expression by Western blot

3 讨论

文献报道，无论是SCLC还是NSCLC患者，其肿瘤组织多有炎症微环境的存在［8］，而炎症微环境中生成的促炎因子（如IL⁃17）不仅可使支气管上皮细胞发生改变，而且还能加剧细胞的损害，促进肺癌的发生与发展［4-5］。

已知IL⁃17 主要的生物学特征是加剧炎症反应，如诱导更多促炎因子和介质的生成。不过，近年来深入研究IL⁃17 后发现，IL⁃17 既能参与炎症性疾病［9］，又可在促进某些肿瘤血管生成、细胞增殖和转移等方面发挥作用［9］。

本研究体外用IL⁃17刺激NSCLC的H1299细胞后进行细胞划痕和Transwell实验发现，IL⁃17刺激能增加细胞的迁移和侵袭，而敲低IL⁃17RA后再行IL⁃17 刺激，其迁移和侵袭能力未见提升。提示，NSCLC 受IL⁃17 刺激时可与其受体结合，最终引发了细胞的迁移和侵袭。

众所周知，细胞行为的变化除了受外界刺激原作用外，还与刺激原诱导的某些转录因子、转录辅激活因子和靶分子的表达紧密相关［10⁃11］。本研究测定受IL⁃17 刺激的H1299 细胞内一些因子变化后发现，转录辅激活因子p300 和MMP2 的表达明显上调，且两者的表达时相基本一致。提示p300 和MMP2升高之间可能存在某种联系。

已知p300 是一含有多个功能结构域的蛋白分子，能作为辅激活因子与转录因子结合，参与靶基因表达的调控［10⁃11］。另MMP2（也称明胶水解酶）是MMP家族的重要成员，它不仅可水解Ⅳ型胶原蛋白和其他生物活性分子，而且还能激活MMP9［10⁃11］，故它是肿瘤侵袭与转移重要的调节因子。

为了进一步探讨p300 表达对NSCLC 细胞迁移与侵袭及MMP2 表达的影响，本研究在H1299 细胞内进行了p300 过表达和敲低的相关实验。结果表明，过表达p300后既可促进NSCLC细胞的迁移和侵袭，也能上调MMP2 的表达，而敲低p300 后由IL⁃17诱导的迁移和侵袭能力及MMP2 的表达均显著降低。鉴于IL⁃17诱导NSCLC细胞p300和MMP2的表达高峰时间明显早于细胞的迁移和侵袭。因此推测，p300 的表达上调或许是通过增加MMP2 的生成，最终促进了细胞的迁移和侵袭。不过，这一推测还有待后续的实验加以证实。