PI3K/Akt调控糖尿病冠状动脉平滑肌细胞BK通道的作用机制

焦国庆，李明秋，吴 莹，王如兴，胡亚玲，纪 丽，LU Tong

1无锡市转化医学研究所，2南京医科大学附属无锡人民医院心脏外科，江苏 无锡 214023；3Mayo Clinic细胞电生理研究室，美国 明尼苏达州罗切斯特 55905

糖尿病严重危害人类健康，往往合并心、脑、肾、视网膜等脏器和组织的并发症，其中以冠状动脉病变尤为严重，可导致心肌梗死、恶性心律失常和心脏猝死等严重并发症，已成为我国急性心肌梗死的最主要危险因素之一［1］。大电导钙激活钾通道（BK通道）广泛分布于冠状动脉平滑肌细胞上，由4个α亚基和4个β亚基组成，其中α亚基形成BK通道的孔区，β亚基为辅助亚基，对BK 通道动力学起重要调节作用。在血管平滑肌细胞上，主要为β1 亚基，参与血管张力调节，对冠状动脉血管舒张收缩功能起重要调节作用［2-3］。高血糖可上调超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的水平，SOD 抑制过氧化氢酶表达，导致细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）显著增加，糖尿病患者体内ROS 增高是糖尿病患者的普遍特征。ROS 是BK 通道的强力抑制剂，使BK通道的生理功能障碍，本课题组以前的研究证实，在糖尿病合并冠心病患者的冠状动脉平滑肌细胞中BK⁃β1降低，BK通道功能障碍［4］。最近的研究表明，细胞氧化应激反应的核因子E2相关因子2（Nrf2）可能参与BK 通道的调节，并可能与E3泛素连接酶引起的BK⁃β1 的分解代谢加快，BK⁃β1降低有关［5-6］。

DNA 依赖的蛋白激酶催化亚单位（DNA⁃Pkcs）属于磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶（PI3K）超家族，与蛋白激酶B（Akt）的473 丝氨酸（S473）的磷酸化（p⁃Akt）有关［7］。以前的研究表明，ROS 能激活细胞内DNA⁃Pkcs 和PI3K/Akt 信号传导通路，调节细胞的生长、分化及细胞凋亡［8-9］。本研究探讨糖尿病中PI3K/Akt信号传导通路是否参与冠状动脉平滑肌细胞中BK⁃β1的调节。

1 材料和方法

1.1 材料

人冠状动脉平滑肌细胞（human coronary ar⁃tery smooth muscle cell，HCASMC，中科院上海细胞研究所），HCASMC 培养基SMBM（Lonza Walkers⁃ville 公司，美国），ROS 检测试剂盒、二甲基亚砜（DMSO）、PI3K 抑制剂Wortmannin（上海碧云天公司），ROS 抑制剂GKT137831（SELLECK 公司，美国）。链脲佐菌素（streptozocin，STZ）（Sigma公司，美国）。抗BK⁃a抗体（Alomona公司，以色列），抗BK⁃β 1 抗体（Abcam 公司，美国），DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt（S473）（Santa Cruz 公司，美国）。SPF 级Spraque Dawley 8～12周龄的雄性大鼠30只（江苏省血吸虫病防治研究所动物中心），体质量（200±30）g。本研究方案经南京医科大学实验动物伦理委员会批准，实验动物的使用和喂养遵循ARVO声明。

1.2 方法

1.2.1 HCASMC的处理

HCASMC 培养于SMBM 培养基，正常糖浓度培养基及高糖浓度培养基葡萄糖浓度分别为5 mmon/L及15 mmon/L。PI3K抑制剂Wortmannin处理组以不含血清的SMBM培养基加入Wortmannin（100 nmon/L）预处理细胞30 min，再以高糖浓度培养基培养48 h（n=3），对照组以终浓度0.1%（w/w）的二甲基亚砜（DMSO）的无血清培养基预处理细胞30 min，再以高糖浓度培养基培养48 h（n=3）。ROS抑制剂GKT137831处理组以GKT137831（20 μmon/L）加入高糖浓度培养的HCASMC 作用48 h（n=3），对照组以终浓度0.1%（w/w）的二甲基亚砜（DMSO）作用于高糖浓度培养的人平滑肌细胞（n=3）。用预冷的磷酸盐缓冲液冲洗细胞3 次，加入RIPA 裂解液，在冰上充分裂解，离心后收集上清液，采用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。

1.2.2 糖尿病大鼠动物模型的建立及处理

20 只大鼠采用STZ 60 mg/kg 腹腔内注射，2 周后测定大鼠血糖浓度，如血糖浓度低于300 mg/dL，则用等剂量STZ 再次腹腔内注射，持续8 周血糖浓度高于300 mg/dL 诊断为糖尿病。10 只大鼠腹腔内注射生理盐水作为正常对照组（Nor，n=10）。20只糖尿病大鼠中，10 只以GKT137831［40 mg/（kg·d）］灌胃2周（DM+GKT，n=10），10只糖尿病大鼠灌胃相同数量的饮用水2 周（DM，n=10），处死大鼠。分离正常大鼠、糖尿病大鼠及经GKT137831灌胃的糖尿病大鼠冠状动脉，冠状动脉分离方法在课题组相关文献中已有详述［6］。简言之，处死的大鼠酒精消毒后，切开大鼠胸腔，将大鼠心脏连同出入心脏的大血管切下，将切下的心血管组织浸入冰冷的缓冲液中（NaCl 145 mmol/L、KCl 4.0 mmol/L、CaCl20.05 mmol/L、MgCl21.0 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、Glucose 10 mmol/L，pH7.20），在外科手术显微镜下使用显微手术器械，自大鼠主动脉根部冠状动脉起始部，沿左侧及右侧冠状动脉走行途径，细微分离右冠状动脉及左冠状动脉。冠状动脉血管组织用液氮速冻后储存于-80 ℃备用。将动脉组织匀浆化，收集总蛋白。

1.2.3 HCASMC及糖尿病大鼠冠状动脉中ROS检测

用细胞渗透荧光探针DCFHDA检测人HCASMC及糖尿病大鼠冠状动脉中的ROS 及GKT137831 对ROS的影响。HCASMC 在5 mmon/L糖浓度（NG组，n=3）、15 mmon/L糖浓度（HG组，n=3）、15 mmon/L糖浓度+GKT137831（HG+GKT组，n=3）孵育48 h后，用PBS洗涤2次，然后加入DCFHDA 10 μL和90 μL无血清SMBM 培养基37 ℃培养30 min，孵育后用PBS洗涤2 次，荧光显微镜480～525 nm检测DCF荧光强度。快速冰冻的大鼠冠状动脉血管环被切割成30 μm厚的切片，并放置在玻璃玻片上（DM，n=3；DM+GKT，n=3）。DCFH⁃DA（25 μmon/L）应用于组织切片，37 ℃避光孵育30 min，荧光显微镜480～525 nm 检测DCF荧光强度，将使用Scion Image软件对DCF信号进行进一步的密度分析。

1.2.4 采用蛋白免疫印迹（Western blot）检测HCASMC及大鼠冠状动脉BK⁃a亚基、BK⁃β1亚基、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt（S473）表达

等量蛋白分别行8%～12%丙烯酰胺凝胶电泳，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4 ℃封闭过夜，洗膜，HRP标记二抗室温封闭2 h。洗膜后再用GAPDH抗血清封闭，ECL试剂盒发光，吸光度分析法定量。

1.3 统计学方法

以SPSS 11.5统计分析软件进行分析，计量资料以均数士标准差（）表示。采用t检验对正常组和糖尿病组BK⁃a、BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt（S473）蛋白表达进行比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同糖浓度下HCASMC中BK⁃α、BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达

与5 mmol/L 葡萄糖浓度下的HCASMC 比较，15 mmol/L葡萄糖浓度下HCASMC中BK⁃α表达无明显变化，BK⁃β1 蛋白表达降低（P＜0.05），DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达增高（P＜0.05，图1）。

图1 Western blot检测不同葡萄糖浓度下HCASMC中BK⁃α、BK⁃β1、DNA⁃PKcs、Akt、p⁃Akt（S473）的表达Figure 1 Expression of BK⁃α，BK⁃β1，DNA⁃PKcs，Akt and p⁃Akt（S473）of human coronary artery smooth muscle cells in different glucose concentrations by Western blot

2.2 Wortmannin 处 理HCASMC 后BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达

HCASMC 以Wortmannin（100 nmol/L）预 处理30 min后，在15 mmol/L葡萄糖浓度的SMBM中培养48 h 并和对照组相比较，Wortmannin 处理组，DNA⁃Pkcs、Akt 的表达无明显变化（P＞0.05），p⁃Akt 蛋白表达量明显降低，BK⁃β1 的表达量明显增高（P＜0.05，图2）。

图2 Western blot检测Wortmannin作用于HCASMC后BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt（S473）的表达Figure 2 Expression of BK⁃β1，DNA⁃Pkcs，Akt and p⁃Akt（S473）of human coronary artery smooth muscle cells treated with Wortmannin by Western blot

2.3 GKT137831作用于15mmol/L糖浓度下的HCASMC48 h后BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达

与15mmol/L糖浓度下的HCASMC比较，15mmol/L糖浓度下HCASMC经GKT137831处理48 h后，DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt蛋白表达降低（P＜0.05），BK⁃β1表达量增高（P＜0.05，图3）。

图3 Western blot检测GKT137831作用HCASMC 48 h后BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达Figure 3 Expression of BK⁃β1，DNA⁃Pkcs，Akt and p⁃Akt（S473）of human coronary artery smooth mus⁃cle cells after treated with ROS inhibitor GKT137831 for 48 h by Western blot

2.4 GKT137831 对HCASMC及大鼠冠状动脉中ROS的影响

DCFH⁃DA 进入细胞，容易被细胞内酯水解将ES 转化为非荧光形式的DCFH，在多种ROS 存在下迅速转化为荧光DCF。15 mmol/L 葡萄糖浓度下的HCASMC 中ROS 明显高于5 mmol/L 葡萄糖浓度（P＜0.05）。经GKT137831处理48 h后，和15 mmol/L葡萄糖浓度组相比，GKT137831 处理后的HCASMC中ROS 含量降低约40%（P＜0.05）。STZ 诱导的糖尿病大鼠经GKT137831 灌胃2 周后，冠状动脉中ROS 含量较未经GKT137831 处理组降低40%（P＜0.05，图4）。

图4 GKT137831 对HCASMC 及糖尿病大鼠冠状动脉ROS的影响Figure 4 ROS Expression of human coronary artery smooth muscle cells and coronary artery from STZ induced diabetic rats treated with GKT137831

2.5 大鼠冠状动脉BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达

和正常大鼠相比较，STZ 糖尿病模型大鼠冠状动脉DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt（S473）表达量分别增加约50%、30%、30%（P＜0.05），BK⁃β1 表达量降低约45%（P＜0.05）；和糖尿病大鼠相比较，GKT137831喂饲2周后的糖尿病大鼠冠状动脉DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt（S473）蛋白表达量明显降低（P＜0.05）、BK⁃β1表达量明显增高接近于正常大鼠水平（P＜0.05，图5）。

图5 Western blot 检测GKT137831 对糖尿病大鼠冠状动脉的BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt（S473）的影响Figure 5 Expression of BK⁃β1，DNA⁃Pkcs，Akt and p⁃Akt（S473）of coronary artery from STZ induced di⁃abetic rats treated with GKT137831 by West⁃ern blot

3 讨论

BK通道是大电导钙激活钾通道的一种，广泛存在于人体的组织细胞和血管平滑肌细胞中，BK通道调节着血管张力，与血管的血流有关。BK通道电流约占冠状动脉平滑肌细胞总钾离子电流的65%，是冠状动脉平滑肌细胞上最主要的钾通道，在糖尿病等疾病状态下，冠状动脉平滑肌细胞BK 通道开放减少，电流密度降低，蛋白表达减弱，BK通道功能障碍，可能是冠状动脉功能受损的最主要原因［10］，因此，积极寻求糖尿病状态下BK 通道蛋白表达减少及功能障碍的原因，对糖尿病状态下冠状动脉疾病的防治，具有重大临床意义。

高糖状态可上调SOD 的水平，导致细胞内ROS显著增加。超氧阴离子自由基和NO反应产生的过氧化亚硝基（OONO-）可抑制大鼠大脑动脉血管平滑肌细胞膜上的BK通道［11］。本课题组以前的研究证实，高糖（22 mmol/L）状态下，转染表达钙激活钾离子通道（hSlo）的HEK293 细胞及HCASMC 中，BK 通道电流密度下降，通道激活和失活动力学减慢。ROS 是BK 通道的强力抑制剂，使BK 通道的生理性激活功能丧失，并且这种抑制效能与敲除BK 通道的β1 亚基相同［4］。本研究中为进一步探讨ROS 是否为高糖状态下HCASMC 中BK⁃β1 表达降低的触发因素，测定了高糖浓度下HCASMC和糖尿病大鼠模型冠状动脉中ROS 水平，证实高糖浓度下HCASMC 和糖尿病大鼠模型冠状动脉中ROS 表达量增高。将ROS 抑制剂GKT137831 作用于高糖培养的HCASMC 发现，HCASMC 中BK⁃β1 表达增高，提示高糖状态下的ROS可能参与了HCASMC中BK⁃β1蛋白调节。

大量研究证据表明，氧化应激时PI3K/Akt 信号通路被激活并通过核因子E2相关转录因子2（Nrf2）激活下游抗氧化基因的表达［12-13］。为了探讨高糖是否通过PI3K/Akt 通路影响BK⁃β1 的表达，在高糖培养的HCASMC 中发现，BK⁃β1 表达明显减少的同时伴有DNA⁃Pkcs、Akt 及p⁃Akt 的表达增高。经GKT137831 作用后的HCASMC 中DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt表达量降低，以PI3K抑制剂Wortmannin（100 nmol/L）预处理细胞后，高糖状态下的HCASMC DNA⁃Pkcs、Akt未见明显变化，p⁃Akt的表达明显降低，BK⁃β1表达明显增加。提示高糖状态下，ROS可能通过PI3K/AKT通路参与BK⁃β1的调节。

为了进一步验证糖尿病中ROS 对冠状动脉平滑肌细胞BK⁃β1 的调节作用，在STZ 诱导的糖尿病大鼠中发现，糖尿病大鼠冠状动脉平滑肌细胞ROS、DNA⁃Pkcs、Akt 及p⁃Akt 表达增高，BK⁃β1的表达量降低。GKT137831灌胃2周后的糖尿病大鼠中冠状动脉平滑肌细胞ROS 表达量降低，DNA⁃PKcs、Akt、p⁃Akt、BK⁃β1 蛋白表达量接近于正常大鼠水平，进一步验证在STZ 诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠冠状动脉平滑肌细胞中，ROS通过PI3K/AKT信号通路调节BK⁃β1亚基的代谢。

糖尿病中调节BK 通道功能和代谢的因素较多，已有的研究结果证实，二十二碳六烯酸调节BK通道的电流和冠状动脉血管张力［14］。Nrf2、MuF1通过泛素化降解途径影响BK⁃β1的分解代谢［6］。本研究结果显示，糖尿病中ROS 可能通过PI3K/AKT 信号通路部分参与冠状动脉平滑肌细胞BK⁃β1 的调节。本研究初步探讨了糖尿病中ROS 对BK⁃β1 调节的可能机制，局限于ROS对BK⁃β1蛋白表达量的研究，ROS 对冠状动脉平滑肌细胞BK 通道电流的影响以及对冠状动脉血管张力的影响尚有待进一步研究。