抗菌肽对育成期母貂免疫功能及肠组织形态的影响

宇晓军，李丹丹，厉学武，王 群，王 光，王利华

(1.青岛农业大学动物科技学院，青岛 266109;2.山东新希望六和集团有限公司，青岛 266000)

肠道健康和免疫功能是影响动物健康的重要因素，在抗病机制中发挥着重要的作用。肠道健康包括肠道形态结构、分泌、屏障等功能[1]，与机体免疫能力密切相关，共同决定着动物能否健康生长，从而影响动物生产效率。水貂的育成期正值每年气温最高的夏季，食物易酸败，加上仔貂肠道等免疫器官发育不完善，所以容易发生肠道等疾病[2]，给养殖业带来经济损失。抗菌肽(antimicrobial peptide,AP)又称抗微生物肽或宿主防御肽[3]，是由多种生物细胞特定基因编码经外界条件诱导产生的一类具有广谱抗细菌、真菌、病毒、原虫，抑杀肿瘤细胞，具有免疫活性等作用的多肽[4-6]。天蚕素抗菌肽是发现最早、研究最彻底、效果最明显的一类抗菌肽[7]，包含离子线性α-螺旋结构[8]，具有热稳定性好、抗菌力强、抗肿瘤活性、无免疫原性等特点，在动物生产中有广泛应用[9]。研究表明，添加天蚕素抗菌肽可以改善动物肠道黏膜形态[10]；降低炎症因子含量，缓解炎症因子带来的损伤[11]；提高817肉鸡生产性能、脏器系数、抗体水平及淋巴细胞转化率，增强机体的免疫力[12]；促进AA肉鸡生长，减少发病率[13]。目前，抗菌肽在水貂生产中研究较少。为提高水貂抗病力，降低水貂发病死亡带来的经济损失，本试验以育成期母貂为研究对象，在饲粮中添加不同水平的抗菌肽，探究其对育成期母貂免疫功能和肠组织形态的影响，确定抗菌肽在水貂养殖生产中的应用效果及适宜添加水平。

1 材料与方法

1.1 材料

抗菌肽购自北京中农颖泰生物技术有限公司，天蚕素活性多肽≥100万IU/g，纯度≥98%。

1.2 试验动物与饲养管理

试验于2020年7月4日-2020年9月6日在山东省海阳市某水貂养殖场进行，选取65日龄体重相近的健康短毛黑母貂。采用单笼棚舍饲养，已完成犬瘟热和细小病毒疫苗接种。每天05：00和17：00各饲喂一次，自由饮水，自然光照。预试期1周，正试期8周。

1.3 试验设计与试验饲粮

试验采用单因素试验设计，60只育成期母貂分为6组，每组10个重复，每个重复1只。各组饲粮中抗菌肽的添加水平分别为0(对照组)、100、200、300、400和500 mg/kg，基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 饲粮组成及营养水平(干物质基础)

1.4 样品采集与指标测定

饲养试验结束后，每组取6只水貂先进行心脏采血，然后进行屠宰试验，剥离各内脏器官、取十二指肠及空肠样品，用于脏器系数、血清和空肠免疫指标的测定，并参考孙伟丽等[14]制作肠组织切片。

1.4.1 脏器系数测定 水貂屠宰后，迅速取出心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏，用滤纸吸干脏器表面的血液后进行称重记录，计算脏器系数。

脏器系数(%)=(器官重量/体重)×100%

1.4.2 血清免疫指标测定 水貂心脏采血10 mL，待血清析出后3 500 r/min离心10 min，将分离出的血清分装在1.5 mL Eppendorf管中，-80 ℃保存备用。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、补体C3(C3)及补体C4(C4)含量。

1.4.3 水貂空肠免疫指标测定 称取1 g空肠组织，加入9 mL PBS(pH 7.4)制作组织匀浆，低温离心机3 500 r/min离心10 min，取上清液。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(购自上海酶联生物科技有限公司)测定分泌型免疫球蛋白(sIgA)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)及溶菌酶(LZM)含量，均使用全波长酶标仪(CFX96，伯乐公司)测定。

1.4.4 水貂肠组织切片制备 分别取十二指肠和空肠肠段2～3 cm，用生理盐水清洗后放入10 mL/L甲醛溶液进行固定。将已固定好的肠道经修整、水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等步骤后，用苏木精-伊红(HE)进行染色，制成肠组织切片。挑选制作合格的切片，在100倍显微镜下观察，每张切片随机选取3个不连续视野，并挑选典型视野拍摄成图片，使用软件ZEN 2011(Blue version)测定肠绒毛长度及隐窝深度，并计算绒毛高度/隐窝深度(V/C)。

1.5 数据统计

试验数据用Excel 2019整理，采用SPSS 24.0进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用Duncan氏法进行多重比较，结果以平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 抗菌肽对育成期母貂脏器系数的影响

由表2可知，抗菌肽可显著影响育成期母貂脾脏指数，对其他脏器系数均无显著影响，与对照组相比，100、300及400 mg/kg抗菌肽组脾脏指数均显著升高(P<0.05)，分别提高50.90%、62.45%和42.24%，各试验组之间无显著差异(P>0.05)。

表2 添加抗菌肽后育成期母貂的脏器系数

2.2 抗菌肽对育成期母貂血清免疫指标的影响

由表3可知，抗菌肽可显著影响育成期母貂血清免疫指标，与对照组相比，各试验组血清C3、C4及IgM含量均显著升高(P<0.05)；100、300、400、500 mg/kg抗菌肽组血清IgA和IgG含量均显著升高(P<0.05)。

表3 添加抗菌肽后育成期母貂的血清免疫指标

2.3 抗菌肽对育成期母貂空肠免疫指标的影响

由表4可知，抗菌肽可显著影响育成期母貂空肠sIgA、TNF-α、IFN-γ和IL-10含量，对IL-1β、IL-8和LZM含量均无显著影响，与对照组相比，100、200、300及500 mg/kg抗菌肽组sIgA含量均显著升高(P<0.05)；100、200及300 mg/kg抗菌肽组IFN-γ含量均显著升高(P<0.05)；100、200、300及400 mg/kg抗菌肽组IL-10含量均显著升高(P<0.05)；各试验组TNF-α含量均显著低于对照组(P<0.05)，且各试验组之间无显著差异(P>0.05)。

表4 添加抗菌肽后育成期母貂的空肠免疫指标

2.4 抗菌肽对育成期母貂肠组织形态的影响

由表5可知，抗菌肽可显著影响育成期母貂十二指肠绒毛高度、隐窝深度、V/C，以及空肠绒毛高度、V/C，对空肠隐窝深度无显著影响，与对照组相比，各试验组十二指肠和空肠绒毛高度均显著升高(P<0.05)；200 mg/kg抗菌肽组十二指肠隐窝深度显著低于400和500 mg/kg抗菌肽组(P<0.05)，V/C显著高于对照组、400和500 mg/kg抗菌肽组(P<0.05)；200、300及400 mg/kg抗菌肽组空肠V/C均显著高于对照组(P<0.05)。

表5 添加抗菌肽后育成期母貂的肠组织形态

水貂十二指肠、空肠组织形态结构见图1、2。由图1、2可知，对照组母貂十二指肠空肠组织绒毛分布稀疏，长度较短，抗菌肽添加组绒毛较长、浓密、整齐完整。

A，对照组；B～F，100、200、300、400和500 mg/kg抗菌肽组。下同

图2 育成期母貂空肠组织切片(100×)

3 讨 论

3.1 抗菌肽对水貂脏器系数的影响

脏器系数是动物试验中非常重要的一项生物学指标，其大小在一定程度上能够反映动物器官的功能强弱[15]。脾脏是机体最大的外周免疫器官，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是各种免疫细胞产生、分化、成熟及进行免疫应答的主要场所，是主要的免疫器官。王莉等[12]研究表明，天蚕素抗菌肽能显著提高21、42日龄817肉杂鸡的胸腺指数、法氏囊指数和脾脏指数；田丽娜等[16]研究发现，抗菌肽Sublancin可提高蛋鸡肝脏指数和脾脏指数；肖发沂等[17]研究表明，抗菌肽可提高断奶仔猪脾脏指数和胸腺指数，这与雷岷等[18]在肉兔上的研究结果一致。本试验结果也表明，饲粮中添加抗菌肽能够提高育成期母貂脾脏指数。研究发现，在饲料中添加抗菌肽可以促进机体免疫器官发育，诱导免疫球蛋白及细胞因子产生，发挥免疫效应[3]。本试验结果也证明，抗菌肽可以提高水貂血清和肠道免疫因子，减少炎症反应，说明抗菌肽可能通过调节血清和肠道免疫，促进免疫器官发育，从而提高水貂免疫力，保持机体健康。

3.2 抗菌肽对水貂血清免疫指标的影响

体液免疫是动物特异性免疫的一个重要方面，如对抗体、病原体和毒素的中和作用，免疫调理吞噬及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，都与免疫球蛋白和抗体水平等有密切关系[19]。免疫系统能够使B淋巴细胞在抗原刺激下增殖分化为浆细胞，产生免疫球蛋白，其在哺乳动物体液免疫中发挥着极其重要的作用[20-21]。其中，IgG主要介导抗感染免疫；IgM是体液机体免疫中出现最早的抗体，具有杀菌激活补体[22]等功能；IgA主要参与黏膜免疫[23]；C3和C4是补体系统的主要成分，在抵抗微生物感染方面起重要作用，激活后具有免疫调节、介导炎症反应、中和毒素、免疫复合物溶解和清除等重要的生物学效应[24]。田丽娜等[16]研究发现，抗菌肽可提高海兰褐壳蛋鸡血清中IgA、IgG和IgM含量，以及脾脏中IFN-γ的表达；刘莉如等[24]研究发现，饲粮中添加不同水平天蚕素抗菌肽可提高蛋鸡血清中IgA、IgG和C3含量；Wu等[25]研究表明，天蚕素抗菌肽可提高猪血清中IgA、IgG、IL-1β和IL-6含量，本试验结果也证实了这一点。这可能与昆虫抗菌肽在机体内通过3条信号通路(Toll样受体信号通路、核转录因子-κB信号通路和丝裂原活化蛋白激酶信号通路)发挥免疫调控作用有关[26]，说明在水貂饲粮中添加抗菌肽能够在一定程度上提高水貂的体液免疫功能，增强其免疫力。

3.3 抗菌肽对水貂空肠免疫指标的影响

肠黏膜免疫屏障主要由GALT(派伊氏结、黏膜淋巴集合体、弥散黏膜淋巴组织及免疫细胞)及其分泌的sIgA、细胞因子等免疫生成物质构成[27]。各种促炎性细胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α等)与抗炎性细胞因子(IL-4、IL-5、IL-10等)之间的协同作用是调节机体炎症发展的关键[28]。sIgA是由小肠隐窝处未分化的M细胞通过多聚免疫球蛋白受体分泌而来，是肠道提供免疫保护的主要免疫球蛋白和黏膜免疫的核心[29]，是衡量肠道健康的重要指标。本试验结果表明，在水貂饲粮中添加适量抗菌肽可以增加水貂空肠sIgA、IFN-γ、IL-10含量，降低TNF-α含量，说明抗菌肽可以缓解肠道炎症引起的损伤，提高机体免疫力。可能是由于抗菌肽作为免疫调节分子调节机体免疫功能，能够抑制脂多糖(LPS)与RAW264.7细胞表面的Toll样受体4(TLR4)结合，从而阻止TNF-α和IL-1β等细胞因子的表达[30]，改变宿主免疫相关基因表达。还有研究发现，天蚕素可以抑制炎性因子的表达，可能是其能与LPS结合，阻止或干扰LPS与TLR4的相互作用，最终抑制了与TLR4相关的下游信号的传导，从而提高机体免疫力，缓解肠道炎症损伤[31]。

3.4 抗菌肽对水貂肠道形态的影响

肠道形态学已经成为评估肠道营养效果的常用研究工具[32]，绒毛高度、隐窝深度及绒毛高度/隐窝深度是肠道结构完整健康的重要指标，绒毛的长度与活性细胞有丝分裂和营养物质的吸收有关[33]。本试验结果表明，抗菌肽可提高水貂十二指肠和空肠肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度，与刘莉如等[34]在海兰褐仔公鸡和李平等[35]在断奶仔猪上的研究一致。可能由于抗菌肽受体富集于空肠和回肠，通过刺激肠道上皮细胞增殖促进空肠和回肠的绒毛生长，并增加绒毛高度/隐窝深度[36]，也可能是由于抗菌肽具有调节肠道免疫屏障，抑制炎性细胞因子产生的作用，降低肠道屏障功能受损程度，减少肠道有害菌对肠黏膜的破坏，进而达到改善肠道黏膜形态的作用[37]。

4 结 论

饲粮中添加天蚕素抗菌肽可促进育成期母貂免疫器官发育，提高机体免疫力，改善肠道形态，建议抗菌肽添加水平为100～200 mg/kg。