脂联素及其受体激动剂在禽脂肪性肝病中的应用展望

崔埕瑜，马 贲，赵佳慧，赵梓娟，陈 雨，曹中赞，栾新红

(沈阳农业大学动物科学与医学学院，沈阳 110161)

脂联素(adiponectin)是一种由脂肪组织分泌的细胞因子。脂联素参与调控糖和脂质代谢、能量调节、免疫反应以及抵抗炎症、氧化应激和细胞凋亡等多种生理功能、分子和细胞事件[1]。尽管脂联素主要由脂肪组织分泌，但研究表明，在人和鼠的骨髓、成骨细胞、胎儿组织、心肌细胞和唾液腺上皮细胞中也有表达[2]。此外，鸡和鹅等禽类的垂体、下丘脑、肝脏、骨骼肌、卵巢、脾脏和肾脏等组织均可表达脂联素[3-4]。肝脏是脂联素的主要靶器官，尤其是在脂肪性肝病中，脂联素具有控制脂类代谢、炎症和纤维化等多种肝功能的能力，在不久的将来，脂联素或可能在预防和治疗禽类乃至其他动物脂肪性肝病方面发挥重要作用。

1 脂联素及其受体

1.1 脂联素及其分子结构

脂联素是一种分子质量约为30 ku的单体糖蛋白。小鼠脂联素由247个氨基酸组成，人脂联素由244个氨基酸组成，鸡和鹅的脂联素由245个氨基酸组成[3-4]。 脂联素由N端信号序列、高变非同源区、含有22个胶原重复序列(8个Gly-X-Pro和14个Gly-X-Y)的胶原结构域和C端C1q样球状结构域组成。脂联素的N端高变区包含一个半胱氨酸残基(小鼠中的Cys-39或人类中的Cys-36)，半胱氨酸残基在脂联素三聚体通过其二硫键形成多聚体的过程中扮演重要角色[5]。 球状结构域和补体因子C1q、Ⅷ型和Ⅹ型胶原以及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等其他蛋白质的结构相似[6]。

最初分泌的脂联素是一种被称为全长脂联素(full-length adiponectin，fAd)的单体，在血浆中形成不同分子质量的复合物。在局部微环境中，fAd可以被活化的单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞分泌的弹性蛋白酶切割成“球状”脂联素(globular form adiponectin，gAd)[7]。在血浆中，脂联素有3种不同分子质量大小的多聚体复合物，即低分子质量三聚体(LMW，大约90 ku)、中分子质量六聚体(MMW，大约180 ku)和由12～18单聚体组成的高分子质量(HMW，360～540 ku)多聚体，每种多聚体都有不同的生物学功能[8]。

1.2 脂联素受体及其信号通路

脂联素主要通过AdipoR1和AdipoR2两种受体发挥生物学功能。AdipoR1和AdipoR2属于七次跨膜结构域受体蛋白家族，与其他G-蛋白偶联受体家族的拓扑结构相反，氨基末端存在于细胞内，羧基末端存在于细胞外。AdipoR1基因编码375个氨基酸的蛋白质，预测分子质量为42.4 ku，AdipoR2基因编码311个氨基酸的蛋白质，预测分子质量为35.4 ku，这两种受体的蛋白质序列有67%的相似性。两种受体蛋白高度保守，小鼠和人的AdipoR1和AdipoR2蛋白分别有95%和97%的相似性。AdipoR1和AdipoR2表达广泛，AdipoR1在骨骼肌和肝脏等各种组织中都有表达，尤其在肌肉组织中表达更高，AdipoR2主要在肝脏中表达。AdipoR1对球状脂联素具有高亲和力，对全长脂联素的亲和力则较低，而AdipoR2对球状脂联素和全长脂联素具有中等程度的亲和力[9]。AdipoR1和AdipoR2含有一个由3个组胺残基协调的锌结合催化位点，接近质膜内表面。脂联素受体的细胞外C末端与脂联素相结合，细胞内N末端与适应性蛋白1(adaptor protein1，APPL1)相结合[10]。APPL1也称为“衔接蛋白”，包含pleckstrin同源结构域(PH)、磷酸酪氨酸结构域(PTB)和亮氨酸拉链基序，APPL1通过其C末端PTB(phosphotyrosine-binding)和CC(coiled-coil)结构域直接与AdipoR1和AdipoR2的细胞内区域结合。APPL1参与AdipoR1和AdipoR2介导腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、过氧化物酶体增殖活化受体α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα)、Ras样GTP酶蛋白5(Rab5)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和神经酰胺激活的下游效应，包括增加葡萄糖摄取和脂质氧化、血管舒张、线粒体生物发生与氧化能力、胰岛素抗性。脂联素通过其受体AdipoR1和AdipoR2与APPL1结合，在骨骼肌、肝脏、心脏、肾脏和胰腺等多种靶组织中启动一系列下游信号传导事件。研究表明，球状和全长脂联素能通过激活AdipoR1和AdipoR2促进AMPK和p38 MAPK的磷酸化，增加PPARα配体的活性，抑制脂肪酸的合成，使脂肪酸氧化和葡萄糖利用增加[11]。

2 脂联素与脂肪性肝病

2.1 脂联素与肝脏脂类代谢

脂联素对脂类代谢的调控作用主要通过调控甘油三酯(triacylglyceride，TG)合成和脂肪酸氧化两条主要途径完成。家禽尤其是水禽(鸭和鹅)的脂类主要来源于内源性的肝脏合成[12]。禽类脂肪的主要形式是TG，在肝脏中，TG合成主要包括脂肪酸从头合成，以及脂肪酸酯化形成TG两个过程。首先，葡萄糖在肝脏中经过糖酵解反应转化为丙酮酸，丙酮酸进入线粒体后经过三羧酸循环，形成乙酰辅酶A；乙酰辅酶A在乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)的作用下，转化为丙二酸单酰辅酶A，进而经过脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FAS)的催化，形成不同长度的脂肪酸[13]。合成的脂肪酸在脂肪酸延长酶(elongation of very long chain fatty acids，ELOVL)和硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearyl coenzyme A dehydrogenase-1，SCD-1)的作用下，进行碳链的延长与去饱和，形成各种长度和饱和度的脂肪酸，其中单不饱和脂肪酸优先酯化形成TG。脂肪酸从头合成的速度主要在转录水平被调控，在此过程中，ACC、FAS和SCD-1是催化脂肪酸合成和酯化成TG的关键酶，固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element-binding protein 1c，SREBP-1c)是调控ACC、FAS和SCD-1的转录因子[14]。脂联素可以通过与其特异性受体AdipoR1结合激活AMPK，活化的AMPK使SREBP-1c的Ser372位点发生磷酸化，抑制SREBP-1c的转录活性，继而减少ACC、FAS和SCD-1等基因的转录[15-16]。

除形成TG外，肝脏合成的脂肪酸还以β氧化的方式在线粒体、内质网和过氧化物酶体等细胞器中在脂酰辅酶A氧化酶(acyl-CoA oxidase，ACO)催化作用下，进行脂肪酸氧化降解成乙酰辅酶A，为肝脏活动提供能量。其中，短链和中链脂肪酸不需要激活可自由穿过细胞膜进入细胞器中。长链脂肪酸需要经肉碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1，CPT-1)转运穿过细胞膜。CPT1是脂肪酸β氧化的限速酶，能够从细胞质中将脂肪酸转移到线粒体中[17]。脂肪酸β氧化过程中这些关键酶基因的表达主要受PPARα转录调控[18]。激活PPARα可以促进脂肪酸β氧化，减少和阻碍肝脏脂肪积累。脂联素能通过与其受体AdipoR2结合，触发PPARα信号通路，激活其下游靶基因的转录，促进肝脏中脂肪酸氧化和脂质分解代谢[9，19]。此外，脂联素活化的AMPK也可以导致PPARα的磷酸化，从而使PPARα活化，PPARα与AMPK相互协同上调CPT-1和ACO的表达，增加脂肪酸氧化，并阻碍脂质合成。再者，由于ACCα能催化丙二酰辅酶A的合成，丙二酰辅酶A是CPT-1的有效抑制剂，脂联素激活的AMPK可以调控ACCα的磷酸化，导致ACCα活性的抑制以及随之而来的丙二酰辅酶A的降低，减少对CPT-1活性的抑制，从而促进脂肪酸氧化[18]。

当肝脏中所产生的脂肪酸超过了通过β氧化途径所降解的脂肪酸量，以及以脂蛋白的形式通过血液从肝脏转运到外周组织所消耗的量时，就会造成脂肪在肝细胞中大量堆积，导致肝脏脂肪变性。脂联素可以通过上述调控途径减少脂肪酸和TG合成，刺激脂肪酸氧化，避免肝脏脂质的异常积聚，预防脂肪性肝病的发生[20-21]。

2.2 脂联素与肝脏炎症

当肝脏脂质代谢异常时，肝脏中过量积累的TG会对肝细胞产生毒性，大量的炎症因子如TNF-α和白细胞介素1β(IL-1β)等就会释放出来，从而诱发炎症。此外，肝脏脂质代谢导致的血浆游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)水平升高可激活巨噬细胞和脂肪细胞表面的Toll样受体4(TLR4)，进而诱导脂肪性肝病的炎症反应[22]。再者，FFA可刺激Bax(Bcl-2 associated X protein)进入溶酶体，促进组织蛋白酶B(cathepsin B)释放入细胞质，进而通过核因子-κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)上调TNF-α的表达，反过来，TNF-α又可诱导TG在肝内积聚，导致肝细胞脂肪变性，并可以增加溶酶体通透性激活NF-κB，从而使肝损伤的恶性循环持久化[23]。越来越多的证据表明，脂联素具有抗炎作用[24]。脂联素抗炎作用的主要靶点是单核细胞和巨噬细胞。单核细胞和巨噬细胞是非特异性和特异性免疫反应的关键调节因子，它们的功能包括吞噬外来抗原、抗原呈递和产生促炎和抗炎细胞因子。脂联素受体AdipoR1和AdipoR2在巨噬细胞中都能表达，并由PPAR配体调节。 在单核细胞中，AdipoR1比AdipoR2更丰富，其表达在单核细胞分化为成熟巨噬细胞时降低，而AdipoR2的表达则保持恒定，是单核细胞主要的脂联素受体[25]。脂联素能抑制髓系祖细胞分化，调节巨噬细胞功能和/或降低TLR4的表达。脂联素可以通过降低NF-κB信号活性抑制有促炎作用的M1巨噬细胞的活化，选择性激活有抗炎作用的M2巨噬细胞增殖来促进抗炎[26]。在巨噬细胞和其他单核细胞中，脂联素能够抑制炎性细胞因子(包括TNF-α、γ干扰素(IFN-γ)、IL-6和IL-1)的表达，以及诱导抗炎信号分子(如IL-10、IL-1R颉颃剂和血红素氧合酶-1(HO-1))的生成[27-28]。

炎性细胞因子是肝脏炎症、细胞死亡和纤维化以及不同程度肝损伤后再生的关键调控物质。在各种类型脂肪性肝炎的动物模型中，外源性脂联素可显著降低高脂饲粮、酒精或脂多糖等诱导的肝脏肿大，增加脂肪酸氧化，减少脂质积聚，抑制肝脏炎症，降低肝脏组织和血浆中的TNF-α水平[29-30]。体外细胞试验表明，脂联素能使乙醇诱导的肝脏巨噬细胞中TLR-4介导的信号正常化，并通过抑制ERK和p38 MAPK信号使脂多糖(LPS)诱导的肝脏枯否细胞等巨噬细胞中的细胞因子TNF-α的产生正常化，从而起到保肝作用[28,31]。此外，脂联素与TNF-α具有相似的结构和相同的信号通路，因此脂联素可以颉颃TNF-α，减轻肝脏炎症[32]。另外，由于TNF-α可以通过干扰SREBP-1c等关键转录调节因子使脂质合成增加[33]，脂联素能通过对抗TNF-α来减少肝脏脂质积聚[34]。

2.3 脂联素与肝脏氧化应激

脂肪性肝病能损害肝细胞线粒体，导致脂肪酸β氧化增加，产生过多活性氧(reactive oxygen species，ROS)自由基，引起氧化应激。氧化应激又可促进NF-κB的活化，介导大量编码促炎细胞因子(IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6)基因的转录，进一步加重肝脏脂肪性炎症损伤[35]。研究表明，脂联素具有广泛的抗机体组织氧化应激的功能。脂联素通过与其受体结合能增加过氧化氢酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的表达，减轻氧化应激[36]。Ikegami等[37]采用重组脂联素处理原代培养骨骼肌细胞，发现细胞内重链铁蛋白、SOD和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的表达上升，ROS水平下降。Li等[38]发现在高糖环境下，脂联素可以增加心肌细胞的抗氧化能力，减少氧化应激反应和细胞凋亡，保护心肌细胞。Ren等[39]发现，脂联素预处理能显著抑制骨骼肌细胞C2C12中ROS水平，增强抗氧化物质核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2 related factor，Nrf2)和血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)的表达，显著抑制线粒体膜电位的下降，增强细胞的抗氧化能力。此外，重组人脂联素蛋白在维持鼠海马神经元HT22细胞线粒体超微结构和跨膜电位，减少ROS、丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)产生，增加SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性，降低线粒体氧化应激对细胞造成的损伤等方面发挥重要作用[40]。

ROS的过量产生是启动肝脏炎症反应的重要因素。脂联素可调节肝脏枯否细胞等巨噬细胞中ROS的产生。外源脂联素处理能降低LPS刺激诱导的经乙醇饲喂后的小鼠肝脏枯否细胞中的ROS产生[41]。此外，球状脂联素通过调节巨噬细胞内NADPH氧化酶阻止乙醇诱导的ROS生成[42]。脂联素对肝脏产生ROS信号通路的负向调控，可能有助于其对肝脏炎症的保护作用。

2.4 脂联素与肝细胞凋亡和自噬

肝脏中饱和脂肪酸的增加会激活肝细胞凋亡，促进脂肪性肝损伤的发生。研究表明，脂联素与其受体相结合可通过多种信号通路调控细胞的增殖和凋亡。脂联素能够通过抑制细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)信号通路的激活，以及通过激活PI3K/AKT信号通路降低Caspase-3的活性，抑制棕榈酸诱导的鼠源心肌细胞H9c2的凋亡[43]。重组人脂联素蛋白能通过激活Janus蛋白酪氨酸激酶2/信号转导子和转录激活子3(JAK2/STAT3)信号通路，继而上调Bcl-2蛋白和下调Bax蛋白的表达，降低Caspase-3水平，抑制缺氧和缺糖导致的鼠海马神经元HT22细胞凋亡的发生[40]。 肝脏星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)和枯否细胞都有AdipoR1和AdipoR2表达。HSC在肝脏受到损伤后被激活，促使胶原分泌和瘢痕组织的形成，导致慢性纤维化或肝硬化。枯否细胞是肝脏损伤和修复的关键介质。慢性炎症诱导的肝细胞坏死和凋亡导致枯否细胞通过TLR-4信号途径释放炎症介质，这些炎症介质诱导HSC的激活，藉此吞噬死亡的肝细胞[28]。脂联素能抑制枯否细胞TLR-4信号，抑制HSCs的增殖和迁移，同时也能使其易于发生Caspase介导的凋亡[44]。

自噬是一种细胞应激适应机制，能通过抑制凋亡避免细胞死亡[45]。自噬过程的激活保证了线粒体受损细胞结构的去除，从而防止线粒体损伤引起的氧化应激和细胞坏死[46]。脂联素与自噬激活之间的相关性已在多种细胞中被报道[47-48]。自噬作为一种细胞适应性机制被激活，能防止肝损伤引起的细胞损伤。脂联素能诱导自噬的激活从而保护肝细胞免受乙醇诱导的凋亡，AMPK信号途径在诱导自噬中扮演着重要角色，脂联素能通过与其受体结合激活AMPK诱导自噬，沉默AMPK能干扰脂联素诱导的自噬基因的表达，从而阻止对乙醇诱导的细胞凋亡的保护[49]。脂联素诱导的自噬可能在其发挥保肝作用方面起着主导作用，通过给予脂联素激活自噬，能够缓解或改善酒精性和非酒精性脂肪肝、肝纤维化和病毒性肝炎等肝脏疾病[50]。

3 脂联素受体激动剂

目前对脂联素的研究较多，但由于单体形式的脂联素不能发挥作用，人工合成的脂联素多聚体结构又不稳定，而且体内脂联素需要较高的血浆浓度，这些均限制了脂联素在临床医学上的直接应用[51]。然而在对脂联素的作用机制研究过程中发现，AdipoR1和AdipoR2在调节机体糖脂代谢、炎症和氧化应激方面扮演重要角色，在肝脏中AdipoR1表达上调激活AMPK，而AdipoR2表达上调激活PPARα，从而发挥其促进脂肪酸燃烧和能量消耗，介导抗炎和抗氧化应激作用。因此，另一种可以替代脂联素的策略是寻找能激活AdipoR1和AdipoR2的小分子化合物，激活脂联素受体，并以此发挥与脂联素相同的生物学作用。

2013年，东京大学药物研究所的Okada-Iwabu等[52]对大量能够结合并激动脂联素受体的小分子化合物进行了筛选，获得了与脂联素作用相似的小分子化合物，将其中一种命名为AdipoRon，并发现这种小分子脂联素受体激动剂在体外可以与AdipoR1和AdipoR2结合，激活AMPK和PPARα信号通路，表现出与脂联素相似的作用。此后，多项研究表明，脂联素受体激动剂能够通过激活AMPK信号通路在肾脏、胃肠道、肌肉、心脏等多种组织发挥调控糖脂代谢、抗氧化应激、抗炎症和抗细胞凋亡作用[53-55]。在肝脏组织，在LPS/D-半乳糖胺(D-Gal)诱导的小鼠急性肝炎模型中，AdipoRon可抑制LPS/D-半乳糖胺暴露小鼠TNF-α的产生，减少肝细胞凋亡，减轻肝损伤，提高存活率[56]。在四氯化碳诱导的小鼠急性肝炎模型中，AdipoRon能显著降低肝脏MDA、总一氧化氮合酶(tNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)的水平，抑制促炎和促纤维化细胞因子(TNF-α、TGF-β1、α-SMA、COL1A1)的产生[57]。

除了AdipoRon，也有其他的脂联素受体激动剂或源自脂联素的短肽已被开发出来[58-59]，其中，Otvos等[60]设计开发的源自脂联素的短肽ADP355，在小鼠血清和血液中表现出良好的稳定性，并能显著降低硫代乙酰胺诱导的肝损伤，抑制肝细胞凋亡，促进受损肝脏细胞的增殖。

4 小 结

肝脏中脂肪酸合成与酯化、脂肪酸转运、脂肪酸氧化、脂肪分解和利用等代谢途径的一条或多条发生异常均可导致脂类代谢紊乱，肝细胞中过度积累TG和FFA导致脂肪变性，脂肪酸氧化增加产生过多ROS引起氧化应激和炎症反应，出现脂肪性肝病。家禽脂肪性肝病多发于肉用仔禽及产蛋禽，导致肝脏脂肪过度沉积，肝功能降低，产蛋率下降，死亡率增高。随着家禽饲养业集约化养殖的快速发展，引起家禽脂肪性肝病的因素也越来越多。基于脂联素及其受体激动剂在调控胰岛素敏感性、脂类代谢、抗氧化应激和炎症方面的生物学作用，将来可以通过药理学、药物化学、生物化学等多种策略，开发出高效的相关临床药物(如脂联素激动剂等)，提高脂联素及其在肝脏中受体的表达水平，预防脂肪性肝病的发生或减缓其带来的危害。